Bei der Exozytose der verkieselten Zellwand von Kieselalgen kommt es zu einem umfassenden Membranzerfall

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 480 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Kieselalgen sind einzellige Algen, die durch Silizium-Zellwände gekennzeichnet sind. Es ist bekannt, dass diese Silica-Elemente intrazellulär in membrangebundenen Silica-Ablagerungsvesikeln gebildet und nach Abschluss exozytiert werden. Wie Kieselalgen die Membranhomöostase während der Exozytose dieser großen und starren Kieselsäureelemente aufrechterhalten, ist unbekannt. Hier untersuchen wir die Membrandynamik während der Zellwandbildung und Exozytose in zwei Modell-Diatomeenarten mithilfe der konfokalen Lebendzellmikroskopie, der Transmissionselektronenmikroskopie und der Kryo-Elektronentomographie. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Mineralphase während ihrer Bildung in enger Verbindung mit den Silica-Ablagerungsvesikelmembranen steht, die eine präzise Form der zarten geometrischen Muster bilden. Wir stellen fest, dass sich während der Exozytose die distale Kieselsäureablagerungsvesikelmembran und die Plasmamembran allmählich vom Mineral lösen und im extrazellulären Raum zerfallen, ohne dass es zu einer merklichen endozytischen Rückgewinnung oder extrazellulären Umnutzung kommt. Wir zeigen, dass innerhalb der Zelle die proximale Silica-Ablagerungsvesikelmembran zur neuen Barriere zwischen der Zelle und ihrer Umgebung wird und die Rolle einer neuen Plasmamembran übernimmt. Diese Ergebnisse liefern direkte strukturelle Beobachtungen der Exozytose von Kieselalgen und deuten auf einen außergewöhnlichen Mechanismus hin, bei dem die Membranhomöostase dadurch aufrechterhalten wird, dass wichtige Membranflecken verworfen und nicht recycelt werden.

Kieselalgen sind eine vielfältige Gruppe einzelliger Algen, die durch Silica-Zellwände mit komplizierten, artspezifischen Formen und hierarchischen Porenmustern gekennzeichnet sind1. Trotz der immensen morphologischen Vielfalt zwischen den Arten weisen die meisten Zellwände von Kieselalgen eine konservierte Anordnung aus zwei ähnlich geformten Silikat-„Schalen“ auf, die sich teilweise überlappen, ähnlich einer Petrischale. Jede „Schale“ für sich besteht aus einem Ventil und einer Reihe von Gürtelbändern. Die Klappen definieren normalerweise die Form der Zelle, sind reich verziert und enthalten hierarchische Porenmuster. Die Gürtelbänder bilden teilweise überlappende Ringe, die die Seitenwände der Zellen umgeben.

Die Bildung der Kieselalgen-Zellwände steht unter biologischer Kontrolle und ist mit dem Zellzyklus verknüpft2,3,4,5. Jede Tochterzelle erbt eine Hälfte der elterlichen Zellwand und bildet direkt nach der Zellteilung eine zweite Klappe. Während des Wachstums der Zelle werden neue Gürtelbänder gebildet und an die neue Klappe angehängt (Abb. S1). Die Verkieselung ist normalerweise ein intrazellulärer Prozess, der innerhalb einer membrangebundenen Organelle, dem Silica Deposition Vesikel (SDV)6,7,8, stattfindet. SDVs sind dünne und längliche Organellen, die unter der Plasmamembran positioniert sind. Die Zelle reguliert die chemische Umgebung im SDV und übt so eine strenge Kontrolle über den Verkieselungsprozess aus, was zu hochspezifischen und reproduzierbaren Zellwandarchitekturen führt9,10,11,12,13. Nach der intrazellulären Reifung werden die Siliciumdioxidelemente exozytiert, um die Zelloberfläche zu bedecken6,14. Solche Exozytose-Ereignisse sind in der Zellbiologie außergewöhnlich, da der Inhalt des SDV eine enorme feste Struktur ist, die abgesondert werden muss, ohne die Integrität der Zelle zu beschädigen.

Bei klassischen Exozytosewegen verschmilzt die Membran eines intrazellulären Vesikels mit der Plasmamembran, um seinen Inhalt in den extrazellulären Raum abzugeben. Die Homöostase der Plasmamembran kann durch eine vorübergehende Fusion aufrechterhalten werden, die die Integration des sezernierenden Vesikels in die Plasmamembran verhindert, oder durch Ausgleich der hinzugefügten Membran durch kompensatorische Endozytose15. Aufgrund ihrer Größe und Steifheit stellt die Sekretion der Zellwände von Kieselalgen jedoch eine große Herausforderung für den Organismus dar. Das neue Ventil bedeckt bis zur Hälfte der gesamten Zelloberfläche (Abb. S1), sodass die Oberfläche der SDV-Membran der der gesamten Plasmamembran ähnelt. Daher würde die Fusion mit der SDV-Membran zu einer fast augenblicklichen Verdoppelung der Plasmamembranfläche führen.

Während frühere Studien mehrere Hypothesen für die Exozytose der Silica-Zellwand in Kieselalgen aufstellten14,16,17,18,19,20,21,22,23 (Abb. S2), haben erhebliche experimentelle Herausforderungen weitere Fortschritte behindert. Einerseits führt die herkömmliche Probenvorbereitung für Ultrastrukturstudien mit Elektronenmikroskopie zu Artefakten wie Membranschrumpfung und Strukturverformung24. Andererseits werden die Vorteile der Lichtmikroskopie bei der Untersuchung der dynamischen Aspekte der Zellwandbildung in lebenden Zellen durch die geringe räumliche Auflösung und den Mangel an molekularbiologischen Werkzeugen für Kieselalgen begrenzt25,26. Aufgrund dieser Einschränkungen sind In-situ-Beobachtungen des SDV im zellulären Kontext spärlich und es fehlen direkte Beweise für die Art des Verkieselungs- und Exozytoseprozesses.

In dieser Studie untersuchten wir die Membrandynamik während der Klappenbildung und Exozytose in zwei Modell-Diatomeenarten, Stephanopyxis turris und Thalassiosira pseudonana, mithilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen, der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und der Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET). Die relativ großen S. turris-Zellen weisen leicht erkennbare Silikatstrukturen auf, die detaillierte Beobachtungen einzelner Klappen und die dynamische Entwicklung ihrer architektonischen Merkmale mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie ermöglichen27,28. Darüber hinaus erhalten wir mithilfe der Kryo-ET hochauflösende 3D-Daten des SDV in T. pseudonana unter nativen Bedingungen29,30. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Klappenexozytose bei beiden Arten mit einem Zerfall der distalen Membranen einhergeht, begleitet von der Umnutzung der proximalen SDV-Membran in eine neue Plasmamembran.

Wir untersuchten die Klappenexozytose bei Kieselalgen, indem wir zwei Arten untersuchten, S. turris und T. pseudonana (Abb. 1). Die Klappen von S. turris sind kapselförmig und zweischichtig aufgebaut. Die proximale Schicht ist dünn, von nanoskaligen Poren perforiert und auf der distalen Seite von einer höher gelegenen Schicht überlagert, die große Polygone bildet (Abb. 1a‘, a“). Die Oberseite der polygonalen Schicht ist abgeflacht und bildet ein „ T'-Form im Querschnitt (Abb. 1a''). S. turris-Zellen bilden Ketten, die durch röhrenförmige Verbindungsverlängerungen aus Siliciumdioxid verbunden sind, die sich von der Spitze der Klappen erstrecken (Abb. 1a, Pfeil). T. pseudonana-Zellen haben die Form eines Fasses und sind viel kleiner, die Ventile sind Scheiben mit einem Durchmesser von etwa 5 μm (Abb. 1b). Kleine Poren perforieren die Silikaschicht, die den Bereich zwischen den radialen Rippen überspannt, und größere röhrenförmige Poren, sogenannte Fultoportulae, schmücken den Rand der Klappe7 (Abb. 1b', b"). Abbildungen 1e und f zeigen sich teilende Zellen während und kurz danach , Klappenbildung. Neu gebildete Klappen werden mit PDMPO angefärbt, einem fluoreszierenden Farbstoff, der während des Prozesses der biologischen Mineralisierung in Siliciumdioxid eingebaut wird31. Der Vergleich der Zellgröße mit der Größe reifer Klappen kurz vor der Exozytose verdeutlicht die enorme Herausforderung, die mit der Exozytose dieser starren Klappen verbunden ist Silica-Zellwände (Abb. 1g, h).

a, b REM-Bilder, die mindestens zwei Proben darstellen. Details der Silica-Ventilstrukturen werden in den Untertafeln in stärkerer Vergrößerung dargestellt. c, d Hellfeld-Lichtmikroskopbilder von zwei S. turris-Zellen in einer Kette, die durch Verbindungsverlängerungen verbunden sind, und mehreren T. pseudonana-Zellen in verschiedenen Stadien während des Zellzyklus. e, f PDMPO-Fluoreszenzbild von zwei verschiedenen S. turris-Tochterzellen während der Klappenbildung und denselben T. pseudonana-Zellen wie in (d) mit neuen, mit PDMPO fluoreszierend gefärbten Klappen. Die Ergebnisse von vier Synchronisationsexperimenten sind in Abb. S3 dargestellt. g, h Schematische Darstellung von S. turris und T. pseudonana mit Darstellung der Situation kurz vor der Exozytose intrazellulär gebildeter Klappen. Maßstabsbalken: 10 μm (a, c, e), 5 μm (d, f), 1 μm (a', a"', b), 500 nm (a"), 100 nm (b', b").

Wir untersuchten die Membrandynamik in S. turris mithilfe der konfokalen Zeitraffermikroskopie lebender Zellen (Abb. 2). Synchronisierte Kulturen wurden mit PDMPO markiert, um die Silica-Bildung zu verfolgen (Abb. S3), und mit FM4-64, um die Plasmamembran anzufärben. FM4-64 ist ein amphiphiler Fluoreszenzfarbstoff, der sich in die Plasmamembran integriert32. Im Gegensatz zu ähnlichen Farbstoffen wie FM1-43, der schnell in eine andere Kieselalge internalisiert wird33, markiert FM4-64 nur die Plasmamembran und infiltriert nicht passiv in S. turris-Zellen (Abb. S4). Während der Verkieselung sind die PDMPO- und FM4-64-Signale nahezu bis zur Auflösung des konfokalen Mikroskops kolokalisiert (Abb. 2a). Dies zeigt eine sehr große Nähe zwischen der Plasmamembran und den wachsenden Silikatstrukturen innerhalb des SDV, nämlich dass die Plasmamembran die SDV-Form auskleidet. Dennoch sind die wachsenden Spitzen der Verbindungsverlängerungen nur mit dem Membranfarbstoff gefärbt, was darauf hindeutet, dass die SDV-Verlängerung der Verkieselung ihrer am weitesten entfernten Teile vorausgeht (Abb. 2a, Pfeil).

a, b Überlagerungsbilder von Fluoreszenzkanälen. a', b' Einzelkanal-FM4-64-Fluoreszenzbilder. a–a' Tochterzellen während der Klappenbildung, markiert mit FM4-64 und PDMPO. Membranen umreißen die wachsenden Polygone und leiten das Wachstum der Verbindungsverlängerungen (Pfeil). b Schnappschüsse aus einem Zeitraffer von Tochterzellen, die die Klappenbildung und Exozytose durchlaufen und nur mit FM4-64 markiert sind. Die seit Beginn der Bildaufnahme verstrichene Zeit wird im Bild angezeigt. b' Ausgeschnittene und vergrößerte Ansicht einer einzelnen Verbindungserweiterung der Zelle in b (durch Kästchen gekennzeichnet). Der Beginn der Exozytose der Klappe ist ab t = 132 zu erkennen, danach sind die Membranreste um die Verbindungsverlängerung nicht mehr mit der Zelle verbunden und zerfallen allmählich. Maßstabsbalken: 20 μm (a, a'), 10 μm (b) und 1 μm (b').

Wir haben einen Zeitraffer der Membrandynamik in S. turris-Zellen aufgezeichnet, die den gesamten Prozess der Klappenbildung und Exozytose durchlaufen (Abb. 2b, Film S1). Die Verkieselung beginnt an der Zellspitze und schreitet radial voran. Der Fortschritt der Klappenbildung wird durch die fluoreszierende Plasmamembran sichtbar gemacht, die die wachsende polygonale Siliciumdioxidschicht umreißt und Verlängerungen verbindet (Abb. 2b, t = 0 bis t = 126). Der Beginn der Exozytose, nämlich die Lockerung des Plasmamembran-SDV-Silica-Komplexes, ist offensichtlich, da die markierte Plasmamembran die Polygone nicht mehr scharf umreißt (Abb. 2b, t = 132). Gleichzeitig beobachten wir eine Verstärkung des Fluoreszenzsignals (Abb. S5), wahrscheinlich aufgrund der Fusion zwischen Plasma und SDV-Membranen, die das SDV-Lumen dem umgebenden Medium aussetzt, aus dem freies FM4-64 infiltrieren und sich verfärben kann die SDV-Membran zusätzlich zur Plasmamembran. Dennoch ermöglicht die begrenzte Auflösung der Fluoreszenzmikroskopie keine räumliche Auflösung des Zusammenspiels zwischen SDV und Plasmamembranen vor und nach der Exozytose (Abb. S6).

Die Verbindungsverlängerungen von S. turris bieten eine einzigartige Gelegenheit, den Exozytoseprozess zu untersuchen, da die alte Plasmamembran diese langen Strukturen vor der Exozytose umgibt, sich die neue Plasmamembran jedoch nach der Exozytose nur an ihrer Basis befindet. Das FM4-64-Signal um die Verbindungsverlängerungen ist während ihres Wachstums kontinuierlich, aber nachdem die Verlängerungen ihre volle Größe erreicht haben, ändert sich das Fluoreszenzsignal in unterbrochene Flecken, die allmählich verschwinden (Abb. 2b, t = 156 und t = 234). Dies steht im Einklang mit einer zuvor veröffentlichten Membranfluoreszenzstudie von Coscinodiscus wailesii33. In einigen Fällen sind die Membranen, die eine Verbindungsverlängerung umgeben, offensichtlich nicht mehr mit dem Zellkörper verbunden (Abb. 2b'). Dieses Markierungsmuster, bei dem Flecken gefärbter Membranen von der Zelle getrennt werden, unterscheidet sich stark von den Erwartungen an einen klassischen Exozytoseprozess, bei dem gefärbte Membranen entnommen und innerhalb der Zelle recycelt werden sollten. Es ist wichtig zu beachten, dass FM4-64 während des gesamten Experiments im Medium vorhanden ist, jedoch nur in einer Lipidumgebung fluoresziert32. Daher markiert es nur strukturell intakte Membranen und wenn eine Membran zerfällt, markiert es die missgebildeten Trümmer nicht mehr. Somit deuten diese Beobachtungen auf ein Szenario hin, in dem sich große Teile der distalen Membranen vollständig von der Hauptzelloberfläche lösen, allmählich zerfallen und ihre Fluoreszenzmarkierung im extrazellulären Raum zwischen kürzlich geteilten Tochterzellen verlieren.

Um den gleichen Prozess mit ultrastruktureller Auflösung zu beobachten, haben wir sich teilende S. turris-Zellen für die TEM-Analyse vorbereitet. Kurz gesagt, synchronisierte Zellen wurden durch Hochdruckgefrieren vitrifiziert und anschließend durch Gefrieren ersetzt und in Harz eingebettet. Dies führt zu einer optimalen Kombination aus der Erhaltung subzellulärer Strukturen im nahezu nativen Zustand gepaart mit der Möglichkeit der Hochdurchsatz-TEM-Bildgebung bei Raumtemperatur. Die nach diesem Verfahren erstellten TEM-Bilder von S. turris-Zellen zeigen eine außergewöhnliche Erhaltung der Zellumgebung und insbesondere der Membranen und anorganischen Inhalte des SDV (Abb. S7).

Wir haben Hunderte von Bildern von 227 Zellen in verschiedenen Stadien des Zellzyklus aufgenommen und durch Kategorisierung und Sortierung dieser Bilder eine Zeitleiste der Klappenbildung und Exozytose in S. turris rekonstruiert (Abb. 3). Zellen mit einem SDV, das eine wachsende Klappe enthielt, wurden als im Stadium der Klappenbildung befindlich klassifiziert (n = 61, Beispiele in Abb. 3a–b dargestellt). In diesen Stadien befanden sich auch drei Lipiddoppelschichten, die proximale und die distale SDV-Membran B. der Plasmamembran, kann deutlich unterschieden werden. Die distale SDV-Membran befindet sich in sehr geringer Nähe zur Plasmamembran, mit einem Abstand von nur 10–30 nm (Abb. 3a „Einschub“). Während der frühen Ventilbildung dehnt sich das SDV nur so weit aus, wie die Silikatablagerung fortgeschritten ist (Abb. 3a"). Wenn die Silikatausfällung radial voranschreitet, dehnt sich das SDV mit aus. Nach der Bildung der porösen Grundschicht bildet sich darauf die polygonale Schicht distale Seite (Abb. 3b–b“, Pfeil). Während des gesamten Verkieselungsprozesses begrenzt die SDV-Membran die wachsende Klappe eng und bildet einen eng begrenzten Raum, in dem die Silikatmorphologie von der SDV-Membran kontrolliert wird. Die Klappe erreicht ihre endgültige Morphologie, während sie noch vollständig im SDV eingeschlossen ist. Wir beobachteten 23 Zellen mit einem intakten SDV, die eine vollständig ausgereifte Klappe enthielten (Abb. 3c–c").

Die linke Spalte zeigt ein repräsentatives Bild jeder Stufe, mit stärker vergrößerten Ansichten der umrahmten Bereiche in den rechten Spalten. Eine Klappenbildung beginnt an der Spitze der Zelle. a' Wachsendes Siliziumdioxid im SDV, das sich direkt unter der Plasmamembran befindet. a" Das SDV endet an der wachsenden Silica-Kante. Der Einschub zeigt die Doppelschichten des proximalen (lila) und distalen (rosa) SDV und der Plasmamembran (gelb) in stärkerer Vergrößerung. b Später während der Klappenbildung, b' die polygonale Schicht (Pfeil) wird auf der Basisschicht gebildet und b" erreicht der wachsende Rand der neuen Klappe den Rand der Elternklappe. c Die Verkieselung des neuen Ventils ist abgeschlossen, während es noch vollständig im SDV eingeschlossen ist. Reife Klappen sind erkennbar an: c' der vollständig ausgebildeten und abgeflachten Polygonalschicht und c' einer ausgeprägten Hakenform am Klappenrand (Pfeil). d Zu Beginn der Exozytose umgeben d' Membranen noch die meisten Teile der neuen Klappe , d“, bilden aber keine vollständige Umschließung mehr (Pfeilspitzen). e Kurz nach der Exozytose verlieren die distalen Membranen von e' ihre strukturelle Integrität (Pfeilspitzen) und e" die Plasmamembran ist nun durchgehend (Pfeil) unter der neuen Klappe. f–f" Nach Abschluss der Exozytose (n = 75) gibt es sie Von den distalen Membranresten sind keine Spuren mehr vorhanden. Rechts neben den Bildern fasst eine Tabelle die Anzahl der in jedem Entwicklungsstadium beobachteten Zellen und die Anzahl der Fälle zusammen, in denen Membraneinstülpungen auftraten (siehe Details in Abb. S8 und Haupttext). Maßstabsbalken repräsentieren 5 μm (a–f), 1 μm (d‘, e‘, f‘), 500 nm (a‘, c‘, c“, d“, e“, f“), 200 nm (a). ", b', b", c' Einschub) und 50 nm (a" Einschub).

In Bildern von 68 Zellen beobachteten wir eine reife Klappe, die mit einigen Diskontinuitäten von SDV-Membranen umgeben ist, dh das SDV bildet keine vollständige Umhüllung. Basierend auf diesen Strukturinformationen definieren wir, dass diese Zellen einer Exozytose unterliegen. Diese Membranunterbrechungen können sehr lokal auftreten, während der Großteil der Klappe noch fest vom SDV umschlossen ist (Abb. 3d–d"). In einem späteren Stadium verändert sich die Membran-Ultrastruktur dramatisch. Die enge Abgrenzung des distalen SDV und des Plasmas Die Membran um die Klappe lockert sich und wir beobachten eine Verschlechterung der strukturellen Integrität der distalen Membranen (Abb. 3e–e"). Die Membran an der proximalen Seite der Klappe geht nun in die Plasmamembran unter der Elternklappe über (Abb. 3e „Pfeil“). Am Ende des Exozytoseprozesses sind die neuen Klappen an ihrer Position unter dem Elterngürtel zu erkennen Banden, während außerhalb des Zytoplasmas keine sichtbaren Spuren der Membranen zu sehen sind (n = 75, Abb. 3f – f").

Wir haben die Mikroskopiedaten der Membran in der Nähe der neu gebildeten Klappen analysiert, um mögliche Anzeichen einer endozytischen Membranentfernung zu identifizieren, die mit dem Recycling der SDV-Membranen verbunden sein könnten. Wir beobachteten sieben Fälle von Membraneinstülpungen in Zellen im Exozytosestadium. Die Größe dieser Einstülpungen variiert zwischen 0,5 und 3 μm (Abb. S8). Allerdings wurden solche Invaginationen in allen Stadien der Klappenbildung und Exozytose mit ähnlichem Auftreten festgestellt (Χ2 (df=2, N=152) = 2,23, p = 0,327) und können daher nicht mit dem Membranrecycling nach der Exozytose in Zusammenhang gebracht werden. Insgesamt stimmen die TEM-Daten mit der Live-Cell-Bildgebung überein, was darauf hindeutet, dass sich die distalen Membranen während der Exozytose der Klappe extrazellulär auflösen, ohne dass es Anzeichen einer Entfernung gibt, während die einzige sichtbare Membran proximal der neuen Klappe die proximale SDV-Membran ist.

Um die zelluläre Organisation so nah wie möglich am ursprünglichen Zustand darzustellen, haben wir Daten der Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) von T. pseudonana-Zellen erfasst, die sich einer Klappenexozytose unterziehen. Aufgrund der geringeren Größe dieser Zellen eignen sie sich für die erforderlichen Probenvorbereitungsschritte für die Bildgebung mit Kryo-ET. Kurz gesagt, wir haben synchronisierte T. pseudonana-Zellen mittels Tauchgefrieren vitrifiziert, dünne Lamellen mit einem fokussierten Ionenstrahl präpariert und dann Elektronentomogramme unter kryogenen Bedingungen erstellt30,34. Von den 59 abgebildeten Tochterzellpaaren befanden sich 15 während oder kurz nach der Exozytose der Klappe, dh vor der Exozytose des ersten Satzes Gürtelbänder. Vier davon befanden sich im Frühstadium der Exozytose, wobei die neue Klappe nur teilweise von SDV-Membranen bedeckt war (Abb. 4a–d).

a, c, e Schnitte durch rekonstruierte 3D-Volumina; Einige Merkmale in den hervorgehobenen Rechtecken sind entsprechend dem Farbcode in b künstlich eingefärbt (pSDV-Membran – proximale SDV-Membran, dSDV-Membran – distale SDV-Membran). b, d Dreidimensionale Oberflächendarstellung segmentierter Volumina. f Schematische Darstellung des vorgeschlagenen Klappen-Exozytosemechanismus von Kieselalgen. a und c zeigen unterschiedliche Positionen auf denselben Tochterzellen, angegeben in f. Maßstabsbalken: 100 nm, Schichtdicke 1,15–5,7 nm. Siehe auch Filme S2, 3.

Abbildung 4a, c zeigt Tomogramme verschiedener Standorte desselben Paares leicht unsynchronisierter Tochterzellen, das linke kurz vor der Exozytose und das rechte während der Exozytose. Die Klappe auf der linken Seite ist noch vollständig vom SDV umschlossen, während die Klappe auf der rechten Seite aufgrund von Diskontinuitäten in der Abdeckung durch die distalen Membranen bereits dem Extrazellulärraum ausgesetzt ist. In beiden Zellen sind drei Lipiddoppelschichten erkennbar. In der Tochterzelle vor der Exozytose ist die erwartete Anordnung der Membranen zu sehen: Die Plasmamembran bedeckt die gesamte Zelle und dicht darunter umgeben die SDV-Membranen die Klappe vollständig (Abb. 4a, b, linke Seite). Während der Exozytose sind die distalen Membranen jedoch an mehreren Stellen verschmolzen und haben ein Netzwerk aus flachen Membransäcken gebildet, wodurch die Membran auf der proximalen Seite der Klappe die äußerste Grenze der Zelle darstellt (Abb. 4a, b, rechte Seite). Eine ähnliche Situation ist an der Klappenperipherie zu beobachten, wo an der distalen Seite der Fultoportula nicht verbundene Membranstrukturen zu sehen sind (Abb. 4c, d, rechte Seite).

In acht Zellpaaren, die sich in späteren Stadien der Exozytose befanden, beobachteten wir große Membranvesikel, die zwischen den kürzlich exozytierten Klappen zweier Tochterzellen und ihren Gürtelbändern positioniert waren (Abb. 4e). In den drei verbleibenden Zellpaaren mit kürzlich exozytierten Klappen konnten wir keine Vesikel oder Membranreste zwischen den beiden Tochterzellen beobachten. Allerdings umschlossen in diesen drei Zellen die Elterngürtelbänder die Tochterzellen nicht, was auf ein späteres Stadium des Zellzyklus hindeutet, in dem alle extrazellulären Trümmer abgebaut worden waren. Bemerkenswerterweise enthielt keine der abgebildeten Zellen knospende endozytische Vesikel oder Anzeichen für die Bildung einer neuen Membran unter der Klappe. Daher deuten die Kryo-ET-Daten darauf hin, dass T. pseudonana denselben Exozytosemechanismus verwendet, den wir aus den für S. turris gesammelten Daten abgeleitet haben, wobei die proximale SDV-Membran in eine neue Plasmamembran umgewandelt wird und die distalen Membranen extrazellulär zerfallen (Abb. 4f).

Die Extrusion der starren Zellwände von Kieselalgen ist ein außergewöhnliches Exozytose-Ereignis, das schwer mit bekannten Exozytose-Mechanismen in Einklang zu bringen ist. Unsere Beobachtungen von abgelösten Membranflecken im extrazellulären Raum von zwei Diatomeenarten, die mit drei Mikroskopietechniken erfasst wurden, sind mit klassischen Exozytosemechanismen nicht vereinbar. Die strukturellen Eigenschaften dieser unverbundenen und losen Membranen nach der Klappenbildung stehen in scharfem Kontrast zur SDV-Ultrastruktur während des Silica-Wachstums, die einen stark begrenzten Raum bildet, der für die Steuerung der Form wachsender Silica-Strukturen von entscheidender Bedeutung ist35,36,37. Daher schlagen wir vor, dass die Exozytose reifer Klappen über einen einzigartigen Mechanismus erfolgt, bei dem die alte Plasmamembran und die distale SDV-Membran in den extrazellulären Raum verworfen werden und die proximale SDV-Membran die Rolle einer neuen Plasmamembran übernimmt (Abb. 4f, S2). . Dieses Szenario steht im Einklang mit früheren Beobachtungen eines schnellen Austauschs von SDV-Proteinen mit der Plasmamembran in Lebendzellstudien von T. pseudonana2,38.

Dieses Szenario wird auch durch die Tatsache gestützt, dass keine der Zellen in unseren Datensätzen Anzeichen einer Verarbeitung oder eines Recyclings der SDV-Membranen oder der Bildung einer neuen Plasmamembran unter der Klappe aufweist. Dennoch sind wir uns bewusst, dass unsere Live-Cell-Bildgebung möglicherweise nicht über die räumliche Auflösung verfügt, um solche Ereignisse zu erkennen, und dass die Elektronenmikroskopie nur Informationen über zufällige Momentaufnahmen in Zeit und Raum liefert. Aus diesen Gründen haben wir eine statistische Analyse durchgeführt, um die Wahrscheinlichkeit zu bestimmen, dass bei der Exozytose tatsächlich das endozytische Recycling der SDV-Membran stattfindet. Das getestete Szenario war, dass die bei S. turris beobachteten ~1 μm-Invaginationen tatsächlich Teil eines solchen endozytischen Entnahmeprozesses sind (Abb. S8). Wenn dies der Fall ist, müssen etwa 1300 solcher Einstülpungen recycelt werden. Wir führten eine statistische Simulation durch (siehe Abschnitt „Unterstützende Informationen“) und gingen dabei von einem Zeitfenster von 10–20 Sekunden aus, in dem sich eine Invagination entwickelt und auf einem Bild sichtbar wird, sowie von insgesamt 30 Minuten für die Exozytose der Klappe. Die Simulation befasst sich auch mit der Wahrscheinlichkeit, dieses Ereignis in einem zufälligen TEM-Dünnschnitt zu „fangen“. Das 10.000-malige Durchführen der Simulation unter den zulässigen Bedingungen von 10 s für eine Invagination ergab, dass solche Invaginationen im Durchschnitt 15 Mal von 68 Beobachtungen erkannt werden sollten (entsprechend den 68 tatsächlichen Beobachtungen, Abb. 3). Darüber hinaus umfasste das simulierte Szenario in mehr als 99,9 % der Fälle die Erkennung von mehr als 7 solcher Ereignisse bei 68 Beobachtungen (entsprechend den 7 beobachteten Fällen, Abb. S8). Daher können wir laut Permutationstest mit einer Wahrscheinlichkeit von p < 0,001 die Möglichkeit einer Internalisierung dieser Membranen durch kompensatorische Endozytose ausschließen.

Das vorgeschlagene Szenario legt nahe, dass bei Exozytose die proximale SDV-Membran zur neuen Plasmamembran wird. Da die SDV- und Plasmamembranen jeweils spezielle, unterschiedliche Aufgaben erfüllen, ist es wahrscheinlich, dass beide einzigartige Lipid- und Proteinzusammensetzungen erfordern, die nach der Fusion angepasst werden müssten. Tatsächlich wurde gezeigt, dass T. pseudonana-Zellen mit SDVs im Vergleich zu Zellen, die keine SDVs enthalten, eine leicht veränderte Lipidzusammensetzung aufweisen, und es wurde gezeigt, dass mehrere Proteine spezifisch mit der SDV-Membran assoziiert sind2,39,40,41. Mögliche Veränderungen an der proximalen SDV-Membran zur Wiederherstellung der plasmamembranspezifischen Lipidzusammensetzung können durch sogenannte Lipidtransferproteine vermittelt werden, Lipidträger, die spezifische Lipide zwischen Donor- und Akzeptormembranen übertragen42. Der Befund, dass die distalen Membranen extrazellulär zerfallen, ist überraschend, da es verschwenderisch erscheint, bei jedem Zellzyklus eine so große Menge an Membranen wegzuwerfen. Die geringe Affinität von FM4-64 zu abbauenden Trümmern schließt die Möglichkeit aus, das Schicksal dieser Membranen zu verfolgen32. Dennoch ist es wichtig zu beachten, dass die Gürtelbänder ein quasi geschlossenes Kompartiment um die neu gebildeten Klappen bilden, was möglicherweise die Diffusion von der Zelle weg verlangsamt und die Aufnahme der Membrantrümmer zur zellulären Verwendung nach dem Zerfall erleichtert. Dadurch können die energetischen Kosten eines solchen Prozesses möglicherweise minimiert werden.

Die Exozytose großer Inhalte wurde auch in anderen Organismen untersucht und zeigte Mechanismen auf, die sich vom klassischen Sekretionsweg zahlreicher kleiner Vesikel unterscheiden, die mit der Membran verschmelzen43. Eine Alternative ist die Exozytose riesiger Vesikel in den Speicheldrüsen von Drosophila, die ihre viskose Fracht durch eine Pore herausdrücken, indem sie die Vesikelmembran zusammenfalten und anschließend die Membran recyceln44. Eine andere Alternative, die Akrosomreaktion, weist überraschenderweise Ähnlichkeiten mit unserem Vorschlag zur Exozytose der Diatomeenklappe auf. Bei diesem Prozess verschmelzen die Plasmamembran und die distale akrosomale Membran an mehreren Stellen und bilden Vesikel, die in der Umgebung verteilt werden, während die proximale akrosomale Membran intakt bleibt und zur neuen Grenze wird, die die Spermien von der Umgebung trennt45,46.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit einen einzigartigen Mechanismus für die Exozytose von Kieselalgen-Kieselsäure vorschlägt, der zwei bemerkenswerte Ereignisse umfasst. Erstens die Umnutzung einer Organellenmembran in eine Plasmamembran und zweitens der großflächige Zerfall von Membranen. Dieser Mechanismus wird von zwei Modelldiatomeenarten gemeinsam genutzt, was darauf hindeutet, dass es sich hierbei um einen allgemeinen Mechanismus handeln könnte. Da der Werkzeugkasten für die genetische Forschung an Kieselalgen wächst, wird es bald möglich sein, die Proteinmaschinerie zu untersuchen, die an der Regulierung dieses Ereignisses beteiligt ist, und ihre Beziehung zur klassischen Exozytose.

S. turris wurde 2004 aus der Nordsee isoliert und von der Gruppe von Prof. Eike Brunner, TU Dresden, bereitgestellt. Kieselalgenkulturen wurden in natürlichem Mittelmeermeerwasser gehalten, das gefiltert, sein Salzgehalt auf 3,5 % korrigiert und mit einem f/2-Nährstoffrezept (Sigma Aldrich) ergänzt wurde, und für Thalassiosira pseudonana (CCMP1335) mit 330 µM Kieselsäure (Sigma Aldrich) ergänzt. Die Kulturen wurden bei 18 °C unter 16/8-stündigen Licht/Dunkel-Zyklen gehalten.

Zur Synchronisierung des Zellzyklus wurden 5 ml einer reifen S. turris-Zellkultur verwendet, um eine neue 50 ml-Kultur zu starten. Nach 48 Stunden Wachstum im normalen 16 L/8 D-Zyklus wurde die Kultur 20 Stunden lang im Dunkeln gehalten. Nach 20 Stunden Dunkelheit wurde die Kultur erneut Licht ausgesetzt. Die T. pseudonana-Synchronisierung erfolgte mithilfe von Si-Mangel, wie zuvor beschrieben7. Um die Kultur in einer exponentiellen Wachstumsphase zu halten, wurden sie in 12/12-stündigen Licht-/Dunkelzyklen gezüchtet und in der Woche vor der Kultursynchronisation jeden zweiten Tag mit frischem Medium verdünnt (1:10). Um einen Si-Mangel auszulösen, wurden 100-ml-Aliquots der Kultur 10 Minuten lang bei 3000 × g zentrifugiert und in Si-freiem künstlichem Meerwasser oder gefiltertem Meerwasser resuspendiert. Dieser Schritt wurde dreimal wiederholt. Die Kulturen (~0,5 Millionen Zellen/ml) wurden dann 12 Stunden lang im Dunkeln unter Rühren in einem Si-freien Medium gehalten, um den Zellzyklus anzuhalten. Dann wurden die Kulturen für weitere 4 Stunden unter Si-Mangel in kontinuierliches Licht überführt. Am Ende der Si-Mangelperiode waren die Zellen auf etwa 10 Millionen Zellen/ml konzentriert und Si wurde auf 330 µM aufgefüllt. Um die Bildung von neuem Siliciumdioxid zu verfolgen, wurde PDMPO [2-(4-Pyridyl)−5-((4-(2-Dimethylaminoethyl-amino-carbamoyl)methoxy)-phenyl)oxazol] (ThermoFisher Scientific, USA) hinzugefügt. Die PDMPO-Fluoreszenz wurde durch Abbildung der Kulturen mit einem Epifluoreszenzmikroskop (Nikon Eclipse Ni-U, ex: 365 em: 525) überwacht. Die meisten sich teilenden S. turris- und T. pseudonana-Zellen wurden nach 9 bzw. 3 Stunden gezählt.

Die Zellen wurden mithilfe der kritischen Punkttrocknung (CPD) für die SEM vorbereitet. Die Zellen wurden in einer Lösung aus 2 % Glutaraldehyd und 4 % Paraformaldehyd in künstlichem Meerwasser 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter Schütteln fixiert. Nach drei Wäschen mit entionisiertem Wasser (Milli-Q® IQ 7003 Ultrapure Lab Water System, Merck) wurden die Zellen durch Waschen in einer abgestuften Reihe von Ethanol dehydriert. Die letzte Wäsche wurde über Nacht in 100 % wasserfreiem Ethanol durchgeführt. Die dehydrierten Proben wurden dann in einem kritischen Punkttrockner unter Verwendung von flüssigem CO2 als Übergangsflüssigkeit getrocknet. Getrocknete Zellen wurden auf einem leitfähigen Kohlenstoffband auf einem Aluminiumstummel platziert.

Die Proben wurden mit 2,5 nm (T. pseudonana) oder 4 nm (S. turris) Iridium (Safematic) sputterbeschichtet und mit einem Rasterelektronenmikroskop Ultra 55 FEG (Zeiss, Deutschland) unter Verwendung von 3–5 kV und einer Blendengröße von 20 abgebildet –30 μm und einem Arbeitsabstand von ca. 3 mm.

Für die Einzelzell-Zeitrafferbildgebung wurde eine Kultur synchronisiert und mit PDMPO (330 µM) gefärbt. Ungefähr 8 Stunden nach dem Ende des Lichtmangels, als die meisten Zellen die Zytokinese durchlaufen hatten, wurde ein Aliquot von 100 µl entnommen und FM4-64 (ThermoFisher Scientific, USA) bis zu einer Endkonzentration von 4–8 µM zugegeben, um die Membranen anzufärben . Nach Zugabe des Membranfarbstoffs wurde ein 20-µl-Tropfen auf einen Objektträger montiert und mit einem Glasdeckglas abgedeckt, wobei Zahnwachs als Abstandhalter verwendet wurde. Die Proben wurden mit einem konfokalen Leica TCS SP8-STED-Mikroskop sichtbar gemacht, das mit einem HCS PL APO 86×/1,20 W motCORR-Objektiv ausgestattet war. FM4-64- und Chlorophyll-Autofluoreszenz wurden mit einem Weißlichtlaser unter Verwendung einer 550-nm-Laserlinie (6 % Laserleistung) bzw. einer 650-nm-Laserlinie (7 % Laserleistung) erfasst. Die PDMPO-Fluoreszenz wurde mit einem 405-nm-Laser (5 % Laserleistung) erfasst. HyD-SMD-Detektoren wurden für PDMPO und FM4-64 verwendet, wobei die Emissionssammelbreite auf 474–530 bzw. 608–640 nm eingestellt war. Die Chlorophyll-Autofluoreszenzemission wurde mit einem HyD-Detektor mit einer Nachweisbreite von 741–779 nm erfasst und der Übertragungskanal wurde mit einem PMT-Detektor erfasst. Die Zellen wurden 2–4 Stunden lang in Abständen von 3–60 Minuten abgebildet. Die Bilder wurden mit Leica Application Suite X v3.5.7 analysiert. Insgesamt wurden über den gesamten Zeitraum Zeitraffer von über 50 Zellen erfasst.

S. turris-Zellen wurden mittels Hochdruckgefrieren (HPF) und anschließender Gefriersubstitution (FS) gemäß zuvor veröffentlichten Protokollen kryofixiert29,47. Synchronisierte Zellen wurden auf einer 5-µm-Filtermembran gesammelt und mit 200 µl Meerwasser in ein Eppendorf-Röhrchen überführt. Nachdem die Zellen 10 Minuten lang sedimentieren gelassen wurden, wurden 2-µl-Aliquots in Aluminiumscheiben (Wohlwend GmbH, Sennwald, Schweiz) pipettiert und direkt in eine Leica ICE-Hochdruckgefriermaschine (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland) geladen. Konzentrierte Diatomeenproben wurden in flüssigem Stickstoff (−192 °C) bei 210 MPa (2048 bar) vitrifiziert. Verglaste Proben wurden in flüssigem Stickstoff bis zur Gefriersubstitution in einem EM ASF2 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland) gelagert. Verglastes Wasser wurde bei (–90 °C) durch ein organisches Lösungsmittel, 100 % wasserfreies Aceton, ersetzt. Anschließend wurde Aceton mit chemischen Fixiermitteln (0,2 % Uranylacetat und 0,2 % Osmiumtetroxid) ergänzt, um die Vernetzung und den Kontrast der Zellstrukturen zu verbessern. Die Proben wurden 48 Stunden lang bei –90 °C in die Lösung eingetaucht und dann 24 Stunden lang allmählich auf –20 °C und dann in einer Stunde auf 0 °C erwärmt. Nach drei Wäschen in Aceton wurde das Aceton durch Epon (Agar Scientific Ltd, Stansted, UK) unter Verwendung von Mischungen mit Gradientenkonzentration (10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 60 %, 80 %, 100 % Epon in Aceton) ersetzt. , zweimal täglich bei Raumtemperatur. Die Probe aus 100 % Epon wurde 72 Stunden lang bei 70 °C gehärtet. Ultradünne Schnitte von 70 nm wurden mit einem Ultramikrotom (Ultracut UCT, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland) geschnitten, das mit einem Diamantmesser (Ultra 45°, Diatome Ltd, Nidau, Schweiz) ausgestattet war. Die Schnitte wurden auf mit Kohlenstofffilm beschichtete Kupfer-TEM-Gitter aufgenommen. Anschließend wurden die Schnitte nachgefärbt, indem man sie auf einen Tropfen Bleicitratlösung legte. Nach dreiminütiger Färbung wurden die Gitter dreimal in Wassertropfen gewaschen und dann durch Abtupfen auf Whatman-Filterpapier getrocknet. Insgesamt haben wir 16 gefrorene Proben vorbereitet, die durch Gefriersubstitution in drei verschiedenen Zyklen weiterverarbeitet wurden, und anschließend Hunderte von Zellen abgebildet.

Die TEM-Proben wurden mit einem Tecnai Spirit TEM (FEI, Eindhoven, Niederlande) abgebildet, das bei 120 kV betrieben und mit einer Gatan Oneview 4k × 4k-Kamera (Gatan Inc., Pleasanton, USA) ausgestattet war.

Synchronisierte T. pseudonana-Zellen wurden durch Tauchgefrieren auf glimmentladenen 200-Mesh-Kupfer-R2/1-Lochkohlenstofffilmgittern (Quantifoil Micro Tools GmbH, Großlöbichau, Deutschland) vitrifiziert. In einem Leica EM GP (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland) wurde 1 µl künstliches Meerwasser auf die Kupferseite pipettiert, um den Medienfluss zum Löschpapier zu verbessern, und 4 µl Zellsuspension bei 7–13 × 106 Zellen/ ml wurde auf der Kohlenstoffseite pipettiert. Die Gitter wurden 6 Sekunden lang von der Rückseite des Gitters abgetupft, bevor sie in ein mit flüssigem Stickstoff gekühltes Bad aus flüssigem Ethan getaucht wurden.

Verglaste Zellen wurden mit dem Zweistrahlmikroskop Zeiss Crossbeam 550 FIB/SEM (Zeiss, Deutschland) zu dünnen Lamellen gemahlen. Die Gitter wurden durch ein In-situ-Gasinjektionssystem mit metallorganischem Platin beschichtet. Die Lamellen wurden in einer Neigung von 12° relativ zur Gitterebene gefräst, wobei das Grobfräsen (auf 1 µm Dicke) zwei Schritte unter Verwendung des Galliumionenstrahls bei 30 kV und einem Strom von 300 pA und 100 pA umfasste. Nach dem Grobfräsen aller Lamellen wurden diese bei einem Strom von 50 pA auf 200 nm verdünnt.

Kryo-Elektronentomographiedaten wurden von 59 Zellpaaren gesammelt. Die Neigungsserie wurde mit einem Titan Krios G3i TEM (Thermo-Fisher Scientific, Eindhoven, Niederlande) aufgenommen, das bei 300 kV arbeitet. Neigungsreihen wurden mit einem K3-Direktdetektor (Gatan Inc., Pleasanton, USA) aufgezeichnet, der hinter einem BioQuantum-Energiefilter (Gatan Inc., Pleasanton, USA) unter Verwendung eines Schlitzes von 20 eV installiert war. Alle Neigungsreihen wurden im Zählmodus bei einer nominellen Vergrößerung von 33.000 × aufgezeichnet, was einer physikalischen Pixelgröße von 0,26 nm entspricht, unter Verwendung des dosissymmetrischen Schemas, beginnend mit der Lamellenvorneigung von –12° und mit 2°-Schritten48. Die in Abb. 4a und c dargestellten Neigungsreihen wurden bei einer Defokussierung von 3 µm und unter Verwendung einer eingesetzten Volta-Phasenplatte aufgenommen. Der Neigungsbereich der Serie lag zwischen −60° und 50°. Die in Abb. 4e dargestellten Neigungsserien wurden bei einer Defokussierung von 7 µm, einer eingesetzten Objektivapertur von 100 µm und einem Neigungsbereich von –66° bis 48° aufgenommen. Neigungsserien wurden mithilfe eines in SerialEM v3.8 implementierten automatisierten Niedrigdosisverfahrens mit einer auf ~100e-/Å2 49 eingestellten Gesamtdosis erfasst. Die Tomogramme wurden mit der IMOD-Software Version 4.9.1250 rekonstruiert. Für die Segmentierung wurde die Amira-Software v2021.2 verwendet (Thermo-Fisher Scientific, Eindhoven, Niederlande). Die Membranen wurden mithilfe des Membranverbesserungsfiltermoduls und manueller Verfeinerung segmentiert51.

Unsere Daten deuten darauf hin, dass Kieselalgen einen überraschenden, nicht-kanonischen Mechanismus nutzen, um ihre Silikatklappen zu exozytieren. Um ein alternatives Szenario zu berücksichtigen, bei dem Kieselalgen einen bekannten kanonischen Mechanismus der Klappenexozytose nutzen, haben wir eine statistische Simulation durchgeführt, die Aufschluss darüber gibt, ob ein solches Szenario wahrscheinlich ist. Bei der kanonischen Exozytose verschmilzt die Membran des sezernierenden Vesikels vollständig mit der Plasmamembran, und die Membranhomöostase wird aufrechterhalten, indem die hinzugefügte Membran durch kompensatorische Endozytose ausgeglichen wird. In dem mutmaßlichen Szenario, das wir untersuchen wollen, wird die SDV-Membran durch kompensatorische Endozytose von Vesikeln konstanter Größe recycelt. Um ein solches Szenario zu simulieren, mussten wir abschätzen, wie viele Vesikel endozytiert werden müssen, um die SDV-Membran bei Klappenexozytose wieder zu internalisieren, und wie viele solcher Vesikel in unserem Datensatz hätten auftauchen müssen.

Ausgehend von den grundlegenden geometrischen Eigenschaften der Diatomeenzelle ist die Oberfläche sowohl der proximalen als auch der distalen SDV-Membranen (mit Ausnahme der Membranen um Verbindungsverlängerungen) ≈ Oberfläche der gesamten Zelle, die zu einer Kapsel vereinfacht werden kann (Abb. S9). Wir haben daher die Fläche einer solchen Kapsel berechnet:

Eine Kapsel ist ein Zylinder mit Halbkugeln an beiden Enden. Die Oberfläche einer Kapsel ist definiert als die Summe der Oberfläche des Zylinders in der Mitte und der kombinierten Oberfläche der beiden Halbkugeln. Zur Berechnung der Kapseloberfläche benötigt man den Radius (r) der Halbkugeln und die Länge des Zentralzylinders (a). S. turris-Zellen haben einen Durchmesser von 20–25 μm, daher haben wir bei der Berechnung einen Radius von 11 μm gewählt. Die Länge des Zylinders (a) entspricht der Gesamtlänge der Zelle abzüglich der Radien der beiden Halbkugeln (60 μm–11 μm–11 μm = 38 μm). Daher beträgt die Oberfläche (SA) der Kapsel (und der SDV-Membran):

In unseren TEM-Daten von S. turris beobachteten wir Membraninvaginationen mit Durchmessern im Bereich von 0,5 bis 1 μm. Die Oberfläche solcher Einstülpungen lässt sich berechnen, indem man ihre Geometrie an die einer Kugel annähert: \({{{{{{\rm{SA}}}}}}}_{{{{{{\rm{Kugel}} }}}}}}=4\pi {r}^{2}\)

Basierend auf den vorherigen Berechnungen ergibt sich, dass die Anzahl der endozytischen Vesikel, die zum Recycling der gesamten SDV-Membran erforderlich sind, beträgt:

Studien zur zeitaufgelösten Endozytose zeigen, dass ein einzelnes Endozytoseereignis eines Vesikels mit einem Durchmesser von 1 μm mindestens 10 s dauern sollte49,50,51,52,53,54,55.

Basierend auf unseren Daten gehen wir davon aus, dass der Recyclingprozess in 30 Minuten abgeschlossen sein sollte.

Zusätzlich zu den zeitlichen Faktoren in den Abschnitten 4 und 5, die die Wahrscheinlichkeit beeinflussen, ein endozytäres Vesikel zu beobachten, gibt es einen räumlichen Faktor, nämlich die Wahrscheinlichkeit, ein solches Vesikel in einer zufälligen TEM-Scheibe zu entdecken. Da die Zellen kapselförmig sind und ungefähr horizontal in den eingebetteten Proben liegen, können wir die räumliche Wahrscheinlichkeit abschätzen, ein Vesikel mit dem Durchmesser x in einem zufälligen Schnitt durch den runden Querschnitt einer Zelle mit dem Durchmesser y zu entdecken (Abb. S9). ): \(\tfrac{x}{y}\) = \(\tfrac{1}{22}\) für ein Vesikel von 1 μm in einem TEM-Schnitt einer S. turris-Zelle von 22 μm.

Unter Berücksichtigung der vier in den vorherigen Abschnitten identifizierten Parameter erstellen wir ein simuliertes Szenario (unter Verwendung von R, Version 4.1.2), in dem es 1274 Ereignisse (Endozytosevesikel) gibt, die innerhalb eines Zeitrahmens von 30 Minuten 10 Sekunden andauern, und die Simulation ist Auswahl zufälliger Schnappschüsse (TEM-Scheiben), bei denen die Wahrscheinlichkeit, ein Ereignis (falls es tatsächlich passiert) zu visualisieren, 0,045 (1/22) beträgt. Da unser TEM-Datensatz sieben mögliche endozytische Vesikel in den 68 S. turris-Zellen enthält, die einer Exozytose unterzogen wurden, haben wir simuliert, wie hoch die Wahrscheinlichkeit ist, dass bei 68 Beobachtungen sieben solcher Ereignisse beobachtet werden. Die Simulation zeigt, dass in >99,5 % der Fälle mehr als sieben endozytäre Ereignisse erkannt werden sollten (Abb. S10A).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle relevanten Daten, die die wichtigsten Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien oder auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Quelldaten werden in diesem Artikel und auf Dryad bereitgestellt, https://doi.org/10.5061/dryad.gxd2547n3. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der in dieser Studie verwendete Code ist über den folgenden Link verfügbar: https://zenodo.org/record/7339127#.Y58SgXZBwuU.

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Wir danken Anne Jantschke, Nathalie Pytlik und Eike Brunner von der TU Dresden für die Bereitstellung von Kulturen. Wir danken Simon Michaeli vom Volcani Institute (ARO) für seinen Beitrag bei der Suche nach der richtigen Live-Cell-Bildgebungsplattform. Dieses Projekt wurde vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union gefördert (Fördervereinbarung Nr. 848339). Im Gedenken an Wolfgang und Ruth Lesser wurde am de Picciotto Cancer Cell Observatory eine Live-Cell-Bildgebung durchgeführt. Die Arbeit wurde vom Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging am Weizmann Institute of Science D.dH unterstützt. wurde von der Sustainability and Energy Research Initiative (SAERI) des Weizmann Institute of Science unterstützt.

Abteilung für Pflanzen- und Umweltwissenschaften, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel

Tod von Haan, Lior Aram, Hadas Peled-Zehavi, Oz Ben-Joseph und Assaf Gal

Kerneinrichtungen für Biowissenschaften, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel

Yoseph Addadi & Ron Rotkopf

Abteilung für chemische Forschungsunterstützung, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel

Nadav Elad & Katya Rechav

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D.dH., führte Experimente durch, analysierte Daten, verfasste und redigierte das Manuskript. LA führte KryoET-Experimente und Datenanalysen durch. Das HPZ führte konfokale Mikroskopie-Experimente durch. YA trug zum experimentellen Design der konfokalen Mikroskopie-Experimente bei. OB half bei der TEM-Probenvorbereitung bei Raumtemperatur. RR führte die statistischen Analysen durch. NE trug zu den CryoET-Experimenten und der Datenanalyse bei. KR half bei der Vorbereitung der FIB-Lamellen. Die AG sorgte für Aufsicht, Finanzierungseinwerbung und überarbeitete Entwürfe.

Korrespondenz mit Assaf Gal.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Kimberlee Thamatrakoln und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

de Haan, D., Aram, L., Peled-Zehavi, H. et al. Bei der Exozytose der verkieselten Zellwand von Kieselalgen kommt es zu einem umfassenden Membranzerfall. Nat Commun 14, 480 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36112-z

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Eingegangen: 04. August 2021

Angenommen: 16. Januar 2023

Veröffentlicht: 30. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36112-z

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