Entwicklung der Oberfläche und des Membranschermoduls reifer menschlicher roter Blutkörperchen während mechanischer Ermüdung

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 8563 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die mechanischen Eigenschaften roter Blutkörperchen (RBCs) ändern sich während ihrer Seneszenz, was zahlreiche physiologische oder pathologische Prozesse in Kreislaufsystemen unterstützt, indem sie entscheidende zelluläre mechanische Umgebungen für die Hämodynamik bereitstellen. Quantitative Studien zur Alterung und Variation der Erythrozyteneigenschaften fehlen jedoch weitgehend. Hier untersuchen wir morphologische Veränderungen, Erweichung oder Versteifung einzelner Erythrozyten während des Alterns mithilfe eines mechanischen In-vitro-Ermüdungsmodells. Unter Verwendung eines Mikrofluidsystems mit Mikroröhren werden Erythrozyten wiederholt einer Dehnung und Entspannung ausgesetzt, während sie sich in einen Bereich mit plötzlicher Kontraktion hinein und aus diesem heraus quetschen. Geometrische Parameter und mechanische Eigenschaften gesunder menschlicher Erythrozyten werden bei jedem mechanischen Belastungszyklus systematisch charakterisiert. Unsere experimentellen Ergebnisse identifizieren drei typische Formveränderungen von Erythrozyten während mechanischer Ermüdung, die alle stark mit dem Verlust der Oberfläche verbunden sind. Wir erstellten mathematische Modelle für die Entwicklung der Oberfläche und des Membranschubmoduls einzelner Erythrozyten während mechanischer Ermüdung und entwickelten quantitativ einen Ensemble-Parameter zur Bewertung des Alterungsstatus von Erythrozyten. Diese Studie liefert nicht nur ein neuartiges In-vitro-Ermüdungsmodell zur Untersuchung des mechanischen Verhaltens von Erythrozyten, sondern auch einen eng mit dem Alter und den inhärenten physikalischen Eigenschaften verknüpften Index für eine quantitative Differenzierung einzelner Erythrozyten.

Bei Säugetieren gehören rote Blutkörperchen (RBCs) zu den wichtigsten Zellen für die Aufrechterhaltung der Lebensbedingungen, während sie kontinuierlich durch Kreislaufgefäße unterschiedlicher Größe und enge Lücken wandern. Während der typischen Lebensdauer von 120 Tagen eines menschlichen Erythrozyten verändert es mit der Zellalterung seine geometrischen und mechanischen Eigenschaften1,2,3 und weist biophysikalische Phänotypen für die Diagnose verschiedener Krankheiten auf4,5. Anders als die Seneszenz kernhaltiger Zellen haben Erythrozyten keinen Zellkern und weisen daher eine einzigartige Regulierung der Zellalterung auf. Während Erythrozyten sich wiederholt durch das Mikrogefäßsystem und die submikronischen interendothelialen Milzspalten (IES) quetschen und das Makrogefäßsystem durchqueren, unterliegen sie einem erheblichen mechanischen Kreislauf durch große elastische Dehnung und Entspannung6. Eine der wichtigsten Fragen für die Erythrozytenbiologie ist die Auswirkung mechanischer Ermüdung auf die Seneszenz von Erythrozyten, die noch nicht quantitativ untersucht wurde.

Während der Zellalterung verlieren Erythrozyten teilweise ihre Membranen, was zu einer Veränderung ihrer Morphologie von einer becherförmigen zu einer stabilen scheibenförmigen bikonkaven Form führt7. Erythrozyten behalten ihre optimale Zellform während langfristiger Zirkulationen bei, indem sie Mikrovesikel8,9 erzeugen und das Zellvolumen10 regulieren, um Zellschäden, einschließlich Membranschäden aufgrund mechanischer Ermüdung und oxidativen Stress3, zu beseitigen. Die Analyse der physikalischen Eigenschaften beim Vergleich junger und gealterter Erythrozyten1,2,11 nutzt die Markierung von Isotopen, Biotin oder glykiertem Hämoglobin (HbA1c) als Marker für das Zellalter11,12 und belegt, dass Volumen und Oberfläche mit der Zellalterung monoton abnehmen. Die Beobachtungen zur Änderung des Membranschermoduls während der Zellalterung stimmen jedoch nicht damit überein, dass Sutera et al.13 einen signifikanten Anstieg des Elastizitätsmoduls der Erythrozytenmembran während der Zellalterung in vivo beobachteten, während Li et al.14 feststellten, dass Retikulozyten steifer seien als die reifen Erythrozyten.

Aufgrund des Fehlens von Zellkern und mRNA reagieren Erythrozyten hauptsächlich passiv auf ihre mechanische Mikroumgebung. Daher ist es wohl wichtig, Erythrozyten während ihrer Lebensdauer mechanischen Stimulationen auszusetzen. Es wurde festgestellt, dass die mechanische Belastung der Milz eine entscheidende Rolle in der Erythrozytenbiologie spielt. Die milzspezifische IES-Struktur erleichtert nicht nur die Reifung durch die Entfernung von Retikulozytenorganellen15, sondern trägt auch zur Veränderung des Membranschermoduls, des Formübergangs5,7,15 und der Eliminierung gealterter oder erkrankter Erythrozyten bei15,16,17. Hier sind Milzströme mit Erythrozyten, die sich durch ein IES von typischerweise 0,65 μm Länge und 2–3 μm Höhe quetschen, entscheidende Merkmale ihrer Vesikelbildung, da die Dichte der Skelett-Membran-Verbindungen bei extrem schmalen Schlitzen bei mechanischer Beanspruchung leicht abnimmt18. Dies wird durch die Entdeckung gestützt, dass in Vesikeln der Erythrozytenbläschen von Personen mit Milzerkrankungen ein größerer Hämoglobinverlust auftritt als in denen von gesunden Personen in vivo19. Darüber hinaus steigt bei Bluterkrankungen wie der hereditären Sphärozytose die Rate des Oberflächenverlusts in Erythrozyten unter zyklischer Belastung der Milz aufgrund der Schwächung der Kohäsion zwischen der Lipiddoppelschicht und dem Zytoskelett17. Daher impliziert der mechanische Zyklus durch Mikrokapillargefäße und enge Lumen als Standardroutine mechanischer Stimulationen in der Lebensdauer roter Blutkörperchen ein zugrunde liegendes mechanisches Prinzip für ihre Reifung und Alterung. Daher sind weitere Untersuchungen erforderlich, um die quantitative Entwicklung der Oberfläche und des Membranschermoduls einzelner Erythrozyten bei mechanischer Zyklisierung im Zusammenhang mit dem Alterungsprozess der Erythrozyten zu verstehen.

Aktuelle Studien zu den Veränderungen der mechanischen Eigenschaften von Erythrozyten verwendeten mechanische Zyklen als typische Belastungen, um die Zellalterung in vitro zu beschleunigen, und verschiedene solcher Modelle wurden getestet. Ein einfaches Modell verwendete rechteckige Mikrokanäle mit einem Querschnitt von \(3\times 4\) μm2, wobei die Verringerung der Verformbarkeit einzelner Erythrozyten mithilfe des Taylor-Parameters20 grob geschätzt wurde. Für zirkulierende Erythrozyten wurden IES-ähnliche Kanäle eingerichtet, die mit mikrofluidischen Technologien hergestellt wurden, und die Variationen in den Erythrozytenprofilen und deren Verformbarkeit wurden bewertet21. Die amplitudenmodulierte Elektrodeformation wurde auch zur wiederholten mechanischen Stimulation von Erythrozyten verwendet, um deren mechanische Ermüdung bei Hypoxie und ATP-Mangel zu untersuchen22,23,24. Um die geometrischen Merkmale von Zellen (z. B. ihre Größe, Oberfläche und Volumen) während des mechanischen Zyklenprozesses präzise und getrennt von ihren mechanischen Eigenschaften (z. B. dem Membranschermodul) zu charakterisieren, müssen geeignetere Modelle erstellt werden.

Um die Variationen geometrischer Merkmale und Membransteifigkeiten einzelner Erythrozyten während ihres mechanischen Zyklus zu messen, schlagen wir eine mikrofluidische Methode zur Simulation des mechanischen Zyklus für einzelne Erythrozyten vor. Ein Mikroröhrchen mit einem Innendurchmesser von etwa 3 μm wurde an ein hydraulisches System mit reversibler Druckregelung angeschlossen. Erythrozyten werden durch plötzliche Kontraktionen aus einem Reservoir durch das Mikroröhrchen herausgedrückt, wobei die Erythrozyten ähnliche Ermüdungserscheinungen erfahren wie in einem Milzspalt. Morphologische Eigenschaften (hauptsächlich becherförmige und bikonkav geformte Erythrozyten), geometrische Parameter (Oberfläche, Volumen) und mechanische Eigenschaften (Membranschermodul) gesunder menschlicher Erythrozyten werden bei jedem mechanischen Zyklus der Zelle präzise gemessen und sofort aufgezeichnet. Mit der vorliegenden Methode beobachteten wir den Flächenverlust während des Radfahrens und identifizierten eindeutig drei typische Formübergänge von Erythrozyten unter Ermüdung. Wir haben mathematische Modelle entwickelt, um die Entwicklung der Oberfläche und des Schermoduls einzelner Erythrozyten während mechanischer Zyklen zu untersuchen. Diese Modelle liefern Einblicke in die Mechanismen, die dem Alterungsprozess von Erythrozyten zugrunde liegen, der durch Oberflächenverlust und Steifigkeitsschwankungen gekennzeichnet ist. Darüber hinaus haben wir einen Ensemble-Parameter als neuartigen biophysikalischen Marker definiert, um den Gesundheitszustand einzelner Erythrozyten auf zellulärer Ebene zu beurteilen. Dieser Parameter könnte in der klinischen Praxis zur Diagnose von Erythrozyten-bedingten Erkrankungen genutzt werden.

Wir haben ein In-vitro-Modell für einen einzelnen RBC-Mechanismus entwickelt (Abb. 1a). Im Gegensatz zu früheren Modellen mit Mikrofluidik, die aus einem Konvergenz-Divergen-Kanal mit einem Bereich mit glattem Übergang in den Querschnitten20 bestehen oder eine zyklische Zugbelastung auf ein anhaftendes Erythrozyten mit elektrischen Feldern einer amplitudenmodulierten Elektrode22 verwenden, ist ein röhrenförmiger Kanal mit etwa 3,0 –3,2 µm Durchmesser wird in eine große Kammer mit einer Erythrozytensuspension getaucht. Die Antriebsdrücke der Strömungen im Kanal können zwischen zwei verschiedenen hydrostatischen Drücken verschoben werden, die höher oder niedriger als der Druck im Inneren der Kammer sind, indem der röhrenförmige Kanal über ein elektrisches Dreiwegeventil mit zwei Flüssigkeitssäulen auf unterschiedlichen Höhen verbunden wird (Abb. 1a). ). Durch die Steuerung des Drucks im Kanal mit einem kompilierten Programm erfahren einzelne Erythrozyten eine plötzliche Kontraktion, gefolgt von einer wiederholten Expansion und Entspannung (Abb. 1b), während sie mit Flüssigkeitsströmen unter hydraulischem Druck in den Mikrokanal eingesaugt oder aus diesem herausgedrückt werden. Mit diesem mechanischen In-vitro-Zyklusmodell für einzelne Erythrozyten konnten wir nicht nur den schwersten mechanischen Ermüdungsprozess von Erythrozyten in vivo nachahmen, sondern auch die Variationen der Oberfläche, des Volumens und des Membranschermoduls jedes Erythrozyten während jeder Runde messen Radfahren.

In-vitro-Modell des mechanischen Zyklus einzelner Erythrozyten unter Verwendung von Mikroröhrenkanälen. (a) Versuchsaufbau. Ein röhrenförmiger Kanal in einer großen Kammer ist über ein elektrisches Ventil mit zwei verschiedenen hydrostatischen Druckquellen verbunden. Bilder der Zellen werden mit einer am Mikroskop montierten CMOS-Kamera aufgenommen und aufgezeichnet. Das Versuchssystem wird von einem Computerprogramm gesteuert. Der interessierende Bereich für die dynamische Messung ist der sich stetig bewegende Bereich der deformierten Zelle. (b) Aufeinanderfolgende Bilder eines Erythrozyten, der sich unter plötzlicher Kontraktion und Expansion in ein Mikroröhrchen hineinquetscht und aus diesem herausgedrückt wird. Der obere Teil zeigt den Ansaugvorgang und der untere Teil zeigt die Entladung und Entspannung der Erythrozyten. Der Maßstabsbalken beträgt 10 μm. (c) Simuliertes Ein- und Auspressen roter Blutkörperchen in den Mikrokanal mit einem Innendurchmesser von 3 μm. Farben kennzeichnen die Konturen der Membrankraftdichte auf die deformierte Membran während des mechanischen Zyklus. (d) Verteilungen der Membrankraftdichte entlang der deformierten Membran während mechanischer Zyklen.

Der Durchmesser des röhrenförmigen Kanals ist so optimiert, dass er im Bereich von 3,0–3,2 µm liegt, um die charakteristische Größe der kleinsten Kapillaren in der Mikrozirkulation oder des IES in der Milz nachzuahmen und die Oberfläche, das Zellvolumen und den Membranschermodul der einzelnen Kapillaren zu messen RBC präzise während jedes Zyklus der mechanischen Ermüdung. Die Reynolds-Zahl der Erythrozyten im Mikroröhrchen betrug etwa 0,02. Anhand der Bilder jeder einzelnen Zelle, die sich während des Ansaugens des Zyklus stetig verformt und sich in Mikroröhrchen unter Unterdruck bewegt, und unter der Annahme, dass die deformierten Erythrozyten unter der Strömung mit niedriger Reynoldszahl im sich stetig bewegenden Bereich achsensymmetrisch sind, wurden die Oberfläche und das Volumen der Zellen ermittelt Erythrozyten wurden aus den diskretisierten Segmentierungen des deformierten Zellprofils integriert, dh Oberfläche (A) und Volumen (V) wurden als Summe der Oberflächen bzw. Volumina der Elementarkegel genommen. Wir haben Eins-zu-Eins-Vergleichsexperimente an vielen Erythrozyten durchgeführt, indem wir deren Oberflächen, Volumina und Membranschermoduli sowohl mit der vorgeschlagenen Mikrofluidik-Methode als auch mit der Mikropipetten-Aspirationsmethode gemessen haben. Zunächst wurde eine Zelle in ein Mikroröhrchen gesaugt, bis die deformierten Profile der Zelle im Steady-State-Bereich aufgezeichnet wurden. Zweitens wurde durch Änderung der Druckdifferenz das Erythrozyten aus dem Mikroröhrchen in die Kammer ausgestoßen. Drittens wurde das gleiche Erythrozyten mit einer 1,8-μm-Pipette abgesaugt und die Oberfläche, das Zellvolumen und der Membranscherelastizitätsmodul des Erythrozyten gemessen. Wir haben festgestellt, dass bei Verwendung von röhrenförmigen Kanälen mit einem Durchmesser im Bereich von 3,0–3,2 µm die Fehler von A und V unter 2 % bzw. 9 % liegen, verglichen mit der Verwendung einer standardmäßigen Mikropipetten-Aspirationsmethode. Wir haben auch die Länge der stetig deformierten Zelle (L) und die Bewegungsgeschwindigkeit der Zelle (\({u}_{c}\)) anhand der aufeinanderfolgenden Bilder der stetig deformierten Zelle, die sich durch Mikroröhren bewegt, berechnet. Zusammen mit dem Durchmesser des Rohrs (D) und der Flüssigkeitsgeschwindigkeit im Kanal unter dem gleichen Unterdruck, aber ohne Zellen (\({u}_{0}\)) verwendeten wir eine maschinelle Lernmethode, um die Membran vorherzusagen elastischer Schermodul von Erythrozyten (\({E}_{s}\)). In dieser Studie verwendeten wir eine neuronale Netzwerkmethode, die mit einem Backpropagation-Algorithmus (BP) trainiert wurde, wobei ein dreischichtiges BP-Netzwerk verwendet wurde, um den Schermodul aus den in den Experimenten beobachteten geometrischen und dynamischen Parametern zu extrahieren.

In der vorliegenden Studie werden aufeinanderfolgende Bilder jedes deformierten Erythrozyten während des mechanischen Zyklus unter Hellfeldmikroskopie mit einem 60-fach-Objektiv (U-Plan-Superapochromat; numerische Apertur 60 x 1,35 NA) mit Doppelspiegel aufgenommen und mit einer CMOS-Kamera aufgezeichnet ( Phantom 410L, Vision Research), wie in Abb. 1a,b dargestellt. Die Kamera läuft mit 200 Bildern pro Sekunde (fps) bei einer Belichtungszeit von 1 ms und einer Bildauflösung von 250 nm bei einer Pixelgröße von 0,167 μm. Ein röhrenförmiger Kanal mit einem Innendurchmesser im Bereich von 3,0–3,2 µm wurde mit einem Pipettenzieher (P-97, Sutter Instrument) und einer Mikroschmiede (Narishige, MF-830) hergestellt und mit einer 1 %igen BSA-PBS-Lösung gefüllt vor Gebrauch. Ein Mikromanipulator (Eppendorf, TransferMan 4r) wurde verwendet, um den Kanal präzise auf Nanometerebene zu halten und zu bewegen. Eine Kammer mit einer Dicke von 2 mm und einer Länge und Breite im Zentimeterbereich wurde vorbereitet und auf dem Tisch eines Umkehrmikroskops (Olympus, IX73) als Reservoir für verdünnte Erythrozytensuspensionen platziert. Der obere und untere Teil der Kammer bestand aus Deckgläsern mit einer Dicke von 0,16 mm, und auf beiden Seiten des Deckglases am Boden wurde gehärtetes Silikon (PDMS, Polydimethylsiloxan) als Stützstruktur verwendet. Die Kammer war mit in PBS suspendierten Erythrozyten gefüllt und der Volumenanteil der Erythrozyten betrug etwa 0,01 %. Unter der Oberflächenspannung der Flüssigkeit kann die Flüssigkeit stabil in der Kammer gespeichert werden. Die Kammer war oben und unten geschlossen und nur kleine Bereiche der Seite waren der Luft ausgesetzt. Die halbgeschlossene Struktur verhindert die Verdunstung und Veränderung des Proteingehalts.

Der mechanische Kreislauf der Erythrozyten wurde durchgeführt, indem zunächst der röhrenförmige Kanal an einen Unterdruck (Pn = − 847 Pa) angeschlossen wurde, nachdem ein einzelner Erythrozyten mit einem Mikromanipulator an ihn herangeführt wurde. Während eine Zelle in das Mikroröhrchen angesaugt wurde und durch dieses floss, wurde der Unterdruck 6 s lang gehalten, so dass sich nach der plötzlichen Kontraktion von der Kammer zum Mikroröhrchen ein stetig deformiertes Profil der Erythrozyten im Röhrchen bildete (Abb. 1b). Zweitens schalteten wir das Dreiwegeventil um, um den hydraulischen Druck im Mikroröhrchen vom negativen auf einen positiven Druck (Pp = 480 Pa) umzustellen, und der Druck wurde 12 s lang gehalten, währenddessen das stetig verformte Erythrozyten in das Mikroröhrchen zurückgeführt wurde Kammer aus dem Mikroröhrchen nach der plötzlichen Expansion (Abb. 1b). Nach dem Ausstoß aus dem Mikroröhrchen brauchen Erythrozyten einige Zeit, um sich von einer verformten Form zu einem spannungsfreien Profil zu erholen, während sie gleichzeitig die Verformungsenergie durch den viskosen Effekt der umgebenden Flüssigkeit dämpfen (Abb. 1b). Während einer vollständigen Runde von 18 s im vorliegenden mechanischen Zyklenmodell benötigt jedes Erythrozyten etwa 2 s im Eingangsbereich des Röhrchens zum Ansaugen, ca. 4 s für die gleichmäßige Verformung und Bewegung im Mikroröhrchen und ca. 4 s für den Rückauswurf die Kammer aus dem Rohr und etwa 8 Sekunden, um sich vor der nächsten Zyklusrunde zu erholen. In unseren Experimenten beträgt der Druckgradient etwa 1 Pa/μm und ähnelt dem physiologischen Zustand von IES. Die Erythrozytengeschwindigkeit in Mikrokapillaren beträgt etwa 500 μm/s und ähnelt der tatsächlichen Geschwindigkeit in Kapillaren.

Numerische Simulationen für das Eindrücken und Austreten einzelner Erythrozyten aus einem Mikroröhrchen mit einem Durchmesser von 3 \(\mathrm{\mu m}\) veranschaulichen die Membranspannungsverteilungen während des mechanischen Zyklierens (Abb. 1c, d) unter Verwendung der Immersed-Boundary-Methoden, wie in Wang et. beschrieben al.25 und Jing et al.26. Die Erythrozytenmembranen durchlaufen entweder in vivo einen Milzspalt oder in vitro ein Mikroröhrchen und erfahren eine Runde von Spannungsschwankungen vom Kopf bis zum Schwanz, wie in den Simulationsergebnissen von Abb. 1d gezeigt. Nahe dem Eingang des Schlitzes oder der Röhre (wobei s = 0 in Abb. 1d) ist der Gradient der Spannungsverteilung entlang der Membran häufig am größten, während die Spannung auf der Membran am Kopf oder Schwanz der deformierten Zelle am stärksten konzentriert ist dargestellt in Abb. 1c. Obwohl die Membranen von Erythrozyten im Vergleich zu einer Zelle, die unidirektional durch IES geht, im Vergleich zu einer Zelle, die unidirektional durch IES geht, unter Verwendung des vorliegenden Ermüdungsmodells doppelt so hohe Belastungsschwankungen erfahren, während Zellen in die Mikroröhrchen einsaugen und diese herausdrücken, wird die Zelle nicht zusätzlich oder anders belastet Membran entsteht, weil die Verteilungen der Membranspannung beim Ansaugen oder Drücken von Zellen nahezu identisch sind, mit vernachlässigbaren Unterschieden vom vorderen zum hinteren Ende, wie in den numerischen Simulationen quantitativ gezeigt. Erythrozyten werden während ihres Zyklus wiederholt und zufällig in verschiedene Richtungen in die Mikrotubuli gezogen, was bedeutet, dass etwaige Defekte in der Membran zufällig auf den Belastungsprozess reagieren können.

Im Vergleich zu anderen mikrofluidischen Geräten20 besteht der Hauptunterschied darin, dass die Spannungsverteilung auf der Membran der zu testenden Zelle bei Verwendung von Mikroröhrchen achsensymmetrisch ist. Forscher ignorieren oft, dass bei der Verwendung einer herkömmlichen Mikrofluidik mit rechteckigem Kanal die Belastung der Zellmembran in der Nähe der vier Ecken des Kanalquerschnitts erhebliche Spannungskonzentrationen darstellt, insbesondere wenn ein schmaler Schlitz für den Durchgang einer Zelle vorgesehen ist, was zu zusätzlichen Belastungen führen kann Spannungskonzentration nahe der Ecke der rechteckigen Kanäle. Ein großer Vorteil der Verwendung des vorliegenden Aufbaus mit Mikroröhrchen anstelle von Mikrofluidik mit rechteckigen Kanälen besteht darin, dass der Weg für die zu testende Zelle am Eingang des Mikroröhrchens einfach ist, sodass der Druckgradient an dieser entscheidenden Öffnung genau festgelegt werden kann Dieser physiologische Druckgradient an den Schlitzen in einem Mikrofluidikkanal ist jedoch oft schwer zu fixieren, da es entlang der Strömungsrichtung im Kanal viele unvermeidliche schwankende Druckverluste durch verschiedene Anschlüsse gibt und komplizierte Strukturen, bevor eine Zelle die entscheidenden Schlitze erreicht. Ein weiterer Vorteil der Mikroröhrchen besteht darin, dass wir die Oberfläche und das Volumen der Erythrozyten während jedes Ermüdungszyklus genau messen konnten, basierend auf Bildern der deformierten Zellen unter achsensymmetrischen Annahmen.

Zu den Einschränkungen des vorliegenden einfachen In-vitro-Modells gehört, dass sich die mechanischen Eigenschaften von Erythrozyten unter starkem Licht zur Visualisierung unter der Mikroskopie aufgrund der thermischen Effekte der Kammer und der ATP-Verarmung nach zweistündigen Experimenten erheblich ändern können. Es ist zu beachten, dass die etwa 200 Zyklen in unserem Modell nicht ausreichen, um den gesamten Prozess der Erythrozytenalterung vollständig nachzubilden. Dennoch kann unser Modell die primären Merkmale von Änderungen der mechanischen Eigenschaften während der Anfangsstadien der RBC-Seneszenz bewerten.

Zur Messung der Zellparameter wurde die Hintergrundsubtraktionsmethode zur Identifizierung der Erythrozytenkonturen verwendet. Als Hintergrundbild wurde ein Bild des Mikroröhrchens ohne bewegte Zellen ausgewählt. Die Schwellenwertverarbeitung wurde verwendet, um das im stationären Hintergrundbereich verbleibende Rauschen zu entfernen, das für die Erkennung der sich bewegenden Ziele irrelevant war. Die Länge der stetig verformten Zelle (L) wurde durch RBC-Konturen berechnet und die Geschwindigkeit der Zelle (\({u}_{c}\)) wurde als Verschiebung der Zellzentren über die Zeit berechnet.

Wir gingen davon aus, dass die deformierten Erythrozyten unter dem Fluss mit niedriger Reynoldszahl im stationären Bereich achsensymmetrisch waren. Dementsprechend wurden die Oberfläche und das Volumen der Erythrozyten anhand der Zellkonturen bestimmt; d. h. die Oberfläche (A) und das Volumen (V) waren die Summen der Oberflächen bzw. Volumina der Elementarkegel, wie folgt:

wobei \({D}_{left}\) und \({D}_{right}\) die Durchmesser der Kegelstümpfe auf der linken bzw. rechten Seite sind und \(h\) die Dicke des diskretisierten Elements ist Kegelstumpf.

Blut von gesunden erwachsenen Freiwilligen mit einem Durchschnittsalter von 27 Jahren (im Bereich von 23–31 Jahren) wurde mit Einverständniserklärung in den Finger entnommen. Das Blut wurde 1:2000 (ungefähr 2 Millionen Erythrozyten pro Milliliter) in Phosphat-Kochsalzpuffer (PBS; CaCl2-frei, MgCl2-frei; pH 7,4; Gibco™) verdünnt, der 1 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA; Sigma–Aldrich), um die Adhäsion an andere Zellen und Gerätewände zu verhindern. Alle Blutproben wurden vor dem Experiment bei 4 °C gelagert und innerhalb von 12 Stunden nach der Probenentnahme aus dem Finger getestet.

Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt und die Einverständniserklärung aller Teilnehmer wurde eingeholt. Alle Experimente wurden im Voraus von der Ethikkommission für Wissenschaft und Technologie der Shanghai Jiao Tong University genehmigt.

Erythrozyten wurden im Verlauf der Experimente individuell als Funktion der Belastungszykluszahl verfolgt. Statistische Analysen wurden mit der SPSS-Software (IBM SPSS Statistics 22, USA) durchgeführt; p-Werte und der Korrelationskoeffizient r wurden durch zweiseitige Pearson-Korrelationstests zwischen verschiedenen physikalischen Parametern derselben Zelle und Belastungszyklen berechnet. Univariable lineare Korrelationsanalysen wurden durchgeführt, um die univariaten Zusammenhänge zwischen physikalischen Parametern und Belastungszyklen zu testen, und p-Werte von weniger als 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

In den vorliegenden experimentellen Daten stammten die Erythrozyten aus dem Fingerbeerblut mehrerer gesunder erwachsener Spender. Unter dem Mikroskop stellten wir fest, dass scheibenförmige, bikonkav geformte Erythrozyten den größten Anteil ausmachten und becherförmige Zellen fast den gesamten restlichen Anteil ausmachten, während selten geformte Erythrozyten wie Akanthozyten kaum vorhanden waren. Der durchschnittliche Anteil der Erythrozyten in bikonkaver und becherförmiger Form beträgt 68,3 % bzw. 31,7 %. Da die Anzahl der becherförmigen Zellen viel größer ist als die Anzahl der Retikulozyten eines gesunden Spenders, die im Normalzustand typischerweise im Bereich von 0,2–2 % aller Erythrozyten liegt, betrachten wir die becherförmigen Erythrozyten hauptsächlich als ausgereift Erythrozyten mit einem etwas größeren Verhältnis von Oberfläche zu Volumen als scheibenförmige, bikonkav geformte Erythrozyten. Das vorliegende mechanische Zyklenmodell simuliert mechanische Ermüdung und ermöglicht die Beobachtung von Übergängen stabiler Formen zwischen den becherförmigen und bikonkav geformten Erythrozyten in vitro (Abb. 2). Basierend auf den anfänglichen Formen und den stabilen Morphologien, die nach einigen hundert Runden mechanischer Zyklen erreicht werden, werden die Formtransformationen von Erythrozyten in drei Kategorien eingeteilt. Hierbei handelt es sich um die Umwandlung von becherförmig zu becherförmig (als C–C bezeichnet), bei der Erythrozyten ihre Becherform während des mechanischen Wechsels beibehalten, die Konkavitätshöhe jedoch mit der Verringerung der Oberfläche allmählich abnimmt; die Umwandlung vom becherförmigen zum bikonkaven Diskozyten (C–D), bei der die Profile der Erythrozyten von der anfänglich becherförmigen Form zur bikonkaven Form übergehen, und die Umwandlung vom Diskozyten zum Diskozyten (D–D), bei dem die Erythrozyten das Diskoid beibehalten bikonkave Form, aber die Zellsphärizität nimmt mit abnehmender Zelloberfläche stetig zu.

Typische Formübergänge von Erythrozyten während mechanischer Zyklen. Bilder veranschaulichen die Formtransformation eines einzelnen Erythrozyten mit Belastungszyklen (n = 0, n \(\ungefähr) 80, n \(\ungefähr) 160). In der C–C-Sequenz behält die Form eine Becherform bei (oben, Draufsicht; unten, Seitenansicht). In der C-D-Sequenz behält die Form bei der Zykluszahl n = 0 und etwa 80 (n \(\ungefähr) 80) einen becherförmigen Stil bei, geht jedoch in eine bikonkave Form über, wenn sich n dem Zyklusnungswert n \(\ungefähr) 160 nähert (oben, Draufsicht; unten, Seitenansicht). In der D-D-Sequenz behält die Form eine bikonkave Form bei (oben, Draufsicht; unten, Seitenansicht). Maßstabsbalken, 5 µm.

Da becherförmige Zellen im Durchschnitt ein größeres Verhältnis von Oberfläche zu Volumen aufweisen als scheibenförmige, bikonkav geformte Zellen und die Oberfläche von Erythrozyten während der Alterung der Erythrozyten häufig monoton abnimmt2, deuten die vorliegenden experimentellen Daten aus unseren mechanischen In-vitro-Ermüdungstests darauf hin, dass mechanische Ermüdung induziert wird Die Form geht während des Alterungsprozesses unidirektional von becherförmig zu bikonkav über. Erythrozyten in der D–D-Gruppe haben den größten Anteil unter allen Erythrozyten, die von gesunden Personen entnommen wurden.

Die mechanischen Eigenschaften jedes Erythrozyten, einschließlich der Oberfläche (A), des Volumens (V) und des Membranschermoduls (\({E}_{s}\)), wurden abgeleitet und für jeden Zyklus während des mechanischen Zyklus aufgezeichnet. Wie in Abb. 3 dargestellt, nehmen die Zelloberfläche (Abb. 3a) und das Volumen (Abb. 3b) linear mit der Zykluszeit ab. Unter Verwendung des Quellverhältnisses definiert als \(\mathrm{Sw}=3\mathrm{V}/4\pi {R}^{3}\), wobei \(\mathrm{R}=\sqrt{A/4\ pi }\) für die Sphärizität der Zelle (d. h. \(\mathrm{Sw}=1,0\) für eine Kugel und \(\mathrm{Sw}=0,64\) für ein typisches gesundes Erythrozyten mit scheibenförmigem bikonkavem Profil), zeigt Abb. 3c dass Erythrozyten dazu neigen, sich mit der Verringerung der Oberfläche während des mechanischen Zyklus aufzurunden, während die Änderung des Zellvolumens zur Oberfläche (dV/dA) konstant bleibt (Abb. 3d). Die Bläschenbildung ist die Haupterscheinung des Membranverlusts während der Zellalterung8,27. Die abgestoßenen Vesikel haben typischerweise eine Größe von 50–100 nm und erscheinen aufgrund des Oberflächenspannungseffekts als kugelförmige Partikel. Der Einschub in Abb. 3d zeigt Hinweise auf die Volumenänderung zum Oberflächenverlust. Wenn Erythrozyten während des Zyklus nur Zellvolumen durch die kugelförmigen Vesikel mit einem Durchmesser von 0,05 μm oder 1,0 μm verlieren würden, ist das Verhältnis des Volumens zur Oberfläche Der Bereich nach dem Abstoßen der Vesikel sollte parallel zu den mit 0,05 μm bzw. 1,0 μm markierten Linien verlaufen. Verglichen mit der Steigung des Volumens zur Oberfläche in Abb. 3d ist der Volumenverlust eines Erythrozyten während des mechanischen Zyklus deutlich größer als der von den vergossenen Vesikeln eingekapselte Volumenverlust, was darauf hindeutet, dass Erythrozyten mit dem Membranverlust während des mechanischen Zyklus ihr Volumen modulieren Morphologien, um die bikonkave Form beizubehalten, indem sie mehr Zytoplasma verlieren und eine größere redundante Oberfläche hinterlassen, um ihre hervorragende Verformbarkeit aufrechtzuerhalten.

Typische Variationen der mechanischen Eigenschaften verschiedener Erythrozyten während mechanischer Zyklen. Änderungen der Oberfläche (a), des Zellvolumens (b), des Quellverhältnisses (c) und des Verhältnisses von Volumen zu Oberfläche mit Zyklen (d). Schräge Linien im Dreieck in (d) stellen das Verhältnis von Volumen zu Oberfläche dar, wobei Volumenverluste mit 50 oder 1000 nm großen sphärischen Vesikeln berücksichtigt werden (obere Linie: 0,05 μm; mittlere Linie: 1 μm; untere Linie: die vorliegenden experimentellen Ergebnisse). beim Radfahren).

Obwohl sich die Oberfläche und das Volumen während der mechanischen Zyklen monoton verringern, hängen die Schwankungen des Membranschermoduls deutlich von der Formumwandlung der Erythrozyten ab. Unter Verwendung des Ermüdungsmodells in vitro mit Mikroröhrchen werden die Alterungsprozesse dieser becherförmigen und bikonkaven Erythrozyten weiter in drei verschiedene Gruppen eingeteilt. Wir fanden heraus, dass die Versteifung der Zellen während der Ermüdung bei bikonkav geformten Zellen zwar monoton ist, die becherförmigen Zellen jedoch abhängig von ihrem anfänglichen und endgültigen Formprofil nach etwa 200 Belastungs-Entspannungs-Zyklen entweder erweichen oder sich stabilisieren könnten schmale Mikroröhrchen. Wie in Abb. 4 gezeigt, nimmt der Schermodul dieser Erythrozyten deutlich ab, wenn sie während des mechanischen Zyklus ihre mit C–C gekennzeichnete Becherform beibehalten (Abb. 4a). Der Schermodul dieser Erythrozyten nimmt leicht ab, bleibt jedoch nahezu konstant, während sie sich von der Becherform in die als CD markierte Diskozytenform verwandeln (Abb. 4b); Der Schermodul steigt mit einer großen Streuung während der mechanischen Zyklen für diejenigen Erythrozyten, die während der Zyklen ihre bikonkave Form beibehalten (Abb. 4c). Nach unserem besten Wissen ist dies das erste Ergebnis, das mit Hilfe eines mechanischen Zyklusmodells zeigt, dass die Steifheit von Erythrozyten in verschiedenen Phasen der durch mechanische Ermüdung verursachten Zellalterung von becherförmig bis bikonkav geformt variiert.

Änderungen des Membranschermoduls während mechanischer Zyklen in verschiedenen Gruppen von Formtransformationen (Mittelwert ± Standardfehler), wobei (a) C–C die in Becherform verbleibenden Erythrozyten bezeichnet, (b) C–D für die Transformation von Becher- in Diskozytenform und (c) D–D für Erythrozyten, die in Diskozytenform verbleiben. Einschübe veranschaulichen die typischen morphologischen Veränderungen verschiedener Gruppen während des Radfahrens.

Weitere detaillierte Korrelationsanalysen zu den mechanischen Eigenschaften von Erythrozyten sind in Abb. 5 dargestellt, wonach das Zellvolumen nicht nur zu Beginn vor dem mechanischen Zyklieren (Abb. 5a), sondern auch zu jedem beliebigen Zeitpunkt während des Zyklierens (Abb. 3d) in engem Zusammenhang mit ihren Oberflächen steht. . Unter allen in der vorliegenden Arbeit gemessenen mechanischen Eigenschaften wird die Oberfläche der Erythrozyten, A, als Schlüsselindikator für die Zellalterung während mechanischer Zyklen ausgewählt, nicht nur, weil die Oberfläche mit der Zellalterung monoton abnimmt2, sondern auch, weil sie unabhängiger ist als das Volumen von Zellen in Bezug auf ihre mechanische oder chemische Umgebung auf zellulärer Ebene6,10. Unter den Zeitreihen der Oberfläche \({A}_{n}\), die während der vorliegenden Experimente zum mechanischen Zyklieren erfasst wurden, wobei der Index n für die Zyklenzeiten steht, ist die anfängliche Oberfläche \({A}_{0} \) eines Erythrozyten vor dem Radfahren, \(n=0\), ist ein wichtiger Parameter, der im durchschnittlichen Sinne das aktuelle Alter des Erythrozyten vor dem mechanischen Radfahren angibt. Unsere Experimente zeigen, dass neben den anfänglichen Zellvolumina (Abb. 5a) und den Membranschermodulen (Abb. 5b) auch die Änderungsraten der Oberfläche \({{A}^{^{\prime}}}_{0} \) und der Schermodul \({{E}^{^{\prime}}}_{S0}\) sind alle stark mit ihren anfänglichen Oberflächenbereichen \({A}_{0}\) korreliert (Abb. 5c ,d) auch.

Korrelationen der mechanischen Eigenschaften von Erythrozyten mit ihren ursprünglichen Oberflächen. (a) Verteilung des Anfangsvolumens \({V}_{0}\) zur Anfangsoberfläche \({A}_{0}\) vor mechanischer Belastung. (b) Verteilung des anfänglichen Membranschubmoduls \({E}_{S0}\) zur Anfangsfläche \({A}_{0}\). (c) Änderungsraten der Oberfläche \({{A}_{0}}^{\mathrm{^{\prime}}}=dA/dn\) während des Radfahrens zu ihrer ursprünglichen Oberfläche \({A}_ {0}\). (d) Änderungsraten des Schermoduls \({E}_{s0}^{^{\prime}}=d{E}_{s}/dn\) während des Radfahrens in Bezug auf die anfängliche Oberfläche \({ A}_{0}\). Dabei bezeichnen r und p in den Abbildungen die Korrelationskoeffizienten bzw. deren Signifikanz zwischen den als Koordinaten gewählten Variablen. Blau, C–C; grün, C–D; rot, D–D.

Wir haben in der vorliegenden Arbeit nur Daten von 17 Zellen erfasst, von denen 10 ursprünglich becherförmig waren (drei behielten die Becherform, 7 wechselten von becherförmig zu bikonkav) und 7 blieben bikonkav -geformt während des gesamten mechanischen Zyklus. Der Durchschnitt und die Standardabweichung von Volumen, Oberfläche und anfänglichem Schermodul betragen 105,7 \(\pm\) 9,8, 143,5 \(\pm\) 11,2 bzw. 5,8 \(\pm\) 1,5. Da es sich bei der vorliegenden Arbeit um eine Einzelzellen-Längsschnittstudie im Vergleich zu den mechanischen Ermüdungszyklen von RBC handelt, handelt es sich bei 17 um eine relativ kleine Anzahl der Gesamtproben, aber wie in den Abbildungen gezeigt. Wie aus den Abbildungen 4 und 5 hervorgeht, sind die Standardabweichungen der gemessenen Variablen recht gering, was darauf hindeutet, dass unsere beobachteten Trends zuverlässig sind.

Wir profitierten von den genauen mechanischen Eigenschaften der Erythrozyten, die während jedes Zyklus mit dem vorliegenden mechanischen Ermüdungsmodell in vitro gemessen wurden, und erstellten ein mathematisches Modell für die Entwicklung der Oberfläche und des Schermoduls einzelner Erythrozyten unter mechanischer Ermüdung. In unseren Experimenten durchlief jedes Erythrozyten innerhalb von 2 Stunden bei Raumtemperatur etwa 200 Zyklen mechanischer Ermüdung. Im Durchschnitt nahm die Oberfläche der Erythrozyten während dieses Ermüdungsprozesses um 10 % ab, wie in Abb. 3a dargestellt. Die vorliegenden experimentellen Daten belegen, dass die Oberfläche von Erythrozyten bei mechanischer Ermüdung exponentiell abnimmt, basierend auf den folgenden zwei verwandten Schätzungen. Erstens passiert ein gesundes Erythrozyten im menschlichen Körper während seiner Lebensspanne insgesamt etwa 1500 Mal die interendothelialen Schlitze (IES) der Milz, was im Durchschnitt etwa 120 Tagen entspricht, da die Zirkulationsperiode des Blutes von Lunge zu Lunge bei gesunden Probanden zwar kürzer ist ca. 55 s, aber während einer Runde der peripheren Blutzirkulation gelangen nur etwa 5 % des arteriellen Flusses durch die Milzarterie in die Milz, und davon greifen nur 15 % in die offene und langsame Zirkulation in der roten Pulpa ein und durchqueren die einzigartige Struktur von das IES nach Henry et al.28. Zweitens neigen Erythrozyten mit zunehmendem Alter dazu, etwa 20 % ihrer Oberfläche zu verlieren. Diese Schätzung stammt von Waugh et al.2, die herausfanden, dass durch die Trennung junger und alter Erythrozyten basierend auf ihrer mittleren zellulären Hämoglobinkonzentration (MCHC) die Oberfläche junger Erythrozyten (mit MCHC etwa 31 g/dl) etwa 18 % größer war als bei gealterten Erythrozyten (mit MCHC > 37 g/dl). Es ist erwähnenswert, dass sich „jung“ und „gealtert“ hier auf unterschiedliche Stadien der Erythrozyten während ihrer etwa 120-tägigen Lebensspanne beziehen. Das heißt, zu Beginn von 200 Runden mechanischer Zyklen, wie sie in den vorliegenden Experimenten durchgeführt wurden, haben frisch gezogene Erythrozyten im Durchschnitt bereits die Hälfte ihrer nutzbaren Oberfläche während des gesamten Alterungsprozesses verloren, der ungefähr 1500 Runden Zyklen erfordert.

Unter der Annahme, dass die Verringerung der Oberfläche \(A\) einem exponentiellen Abfall während der mechanischen Zyklen unterliegt, wird die Oberfläche bei jeder gegebenen Runde mechanischer Zyklen n wie folgt formuliert:

wobei \({A}_{n}\) die Oberfläche eines RBC nach dem \(n\)-ten Zyklus ist. \({A}_{\infty }\) ist die maximale verbleibende Fläche eines Erythrozyten, bevor er am Ende seiner Lebensdauer aus dem Kreislaufsystem ausgeschieden wird. Dies ist die endgültige Oberfläche, auf die ein Erythrozyten nach einer unendlichen Zeit allmählich zerfällt Anzahl der Zyklen theoretisch. Betrachtet man die Zeiten des Radfahrens \(n\) als zeitlichen Index, so ist die Oberfläche zunächst vor dem Radfahren gegeben durch \({A}_{0}=a{e}^{-k{n}_{0}} +{A}_{\infty }\), das den aktuellen Status der Zelle darstellt. Wenn \(n=-{n}_{0}\), das heißt, wenn wir die Oberfläche eines Erythrozyten vom aktuellen Status \({A}_{0}\) bis zum Zeitpunkt der Geburt der Zelle zurückverfolgen könnten, Die Oberfläche der neugeborenen Zelle sollte \({A}_{b}=a+{A}_{\infty }\) betragen. Dann ist die biophysikalische Bedeutung von \(a\) klar, dass es für die Gesamtoberfläche steht, die ein einzelnes Erythrozyten während seines gesamten Lebenszyklus von der Geburt bis zum Tod verlieren kann, und \(a{e}^{-k{n }_{0}}\) steht für die verbleibende Oberfläche, die ein durchschnittlicher RBC seit seinem aktuellen Zustand verlieren wird. \(k\) ist der Koeffizient für den Oberflächenabfall, und wir gehen davon aus, dass \(k\) für alle Erythrozyten desselben Individuums identisch ist. Unter mehreren Parametern \(\left({A}_{n},n,a,k, {n}_{0},{A}_{\infty }\right)\) im mathematischen Modell für einen einzelnen RBC, \({A}_{n}\) und \(n\) werden direkt aus den vorliegenden Experimenten gemessen, und \(k\) und \({A}_{\infty }\) werden durch Daten erhalten Analyse, wohingegen \(a\) und \({n}_{0}\) nicht explizit entschieden werden können. Hier soll n ein kontinuierlicher Parameter sein, der jedoch in den Experimenten durch jede Zyklus- und Messrunde diskretisiert wird.

Im vorliegenden mathematischen Modell werden mehrere Parameter \(\left(a,k, {n}_{0},{A}_{\infty }\right)\) mit deterministischen biophysikalischen Bedeutungen verwendet, aber die Parametermatrix ist schwierig Aufgrund der Heterogenität der Zellen ist es mit den vorliegenden experimentellen Daten nicht möglich, explizit nach jedem einzelnen Erythrozyten zu suchen. Unter Verwendung der Eigenschaften der Exponentialfunktion wird die Änderungsrate der Zelloberfläche wie folgt angegeben

Theoretisch kann ein Satz von Gleichungen für \({{A}^{^{\prime}}}_{n}\), \({A}_{n}, {A}_{\infty }\) sein mit den experimentellen Daten während des Radfahrens formuliert werden. Allerdings wurden in den experimentellen Daten während aufeinanderfolgender Runden Schwankungen von \({{A}^{\mathrm{^{\prime}}}}_{n}\) und \({A}_{n}\) beobachtet Zyklen (Abb. 3a) beeinflussen die Genauigkeit der Auswertung, die sowohl auf die Instabilität der Flüssigkeitsströme im Mikrokanal bei einer sich verformenden Zelle als auch auf Fehler in der Bildverarbeitung zurückzuführen sind. Um hier die longitudinalen experimentellen Daten einer einzelnen Zelle während des Zyklus zu nutzen, aber lokale Schwankungen zu vermeiden, haben wir die folgenden Behandlungen durchgeführt.

Zunächst berechnen wir die Änderungsrate der Oberfläche eines einzelnen Erythrozyten, indem wir alle experimentellen Datenpunkte entlang der 200 Zyklen anpassen. Verwenden Sie dann den resultierenden Durchschnittswert, der mit \(<{{A}^{\mathrm{^{\prime}}}}_{n}>\) bezeichnet wird, als anfängliche Änderungsrate \({{A}^). {\mathrm{^{\prime}}}}_{0}\ approx <{{A}^{\mathrm{^{\prime}}}}_{n}>\).

Obwohl wir davon ausgehen, dass die Oberfläche über den gesamten Alterungsprozess hinweg exponentiell abnimmt, erlebt in den vorliegenden Experimenten in vitro jedes einzelne Erythrozyten nur etwa ein Zehntel seines gesamten Lebenszyklus. Dadurch konnte die Änderungsrate unter einer linearen Annahme mit akzeptablen Abweichungen innerhalb des Bereichs angenähert werden. Zweitens gehen wir davon aus, dass der Wert von k für alle Erythrozyten einer bestimmten Person konstant bleiben muss. Dadurch wird sichergestellt, dass die endgültigen Oberflächen der Erythrozyten des Individuums, bezeichnet als \({A}_{\infty }\), mithilfe von Gleichung berechnet werden können. (2), der besagt, dass \({A}_{\infty }=({{A}^{^{\prime}}}_{0}+k{A}_{0})/k\) . Das heißt, \(k\) wird unter Verwendung der Methode der kleinsten Quadrate mit allen Daten von Erythrozyten eines einzelnen Individuums in der Ebene von (\({{A}^{^{\prime}}}_{0}, { A}_{0})\), wie in Abb. 6a gezeigt. Auf diese Weise können der \(k\) für eine Gruppe von Proben jedes einzelnen Individuums und der \({A}_{\infty ,i}\) für jedes einzelne Erythrozyten unter diesen Proben charakterisiert werden.

Mathematische Modellierung der Dynamik einzelner RBC-Bereiche. (a) Kleinste-Quadrate-Anpassung aller Erythrozytendaten eines einzelnen Individuums in der Ebene von (\({{A}^{^{\prime}}}_{0}, {A}_{0})\) erhalten Sie \( k\) und \({A}_{\infty }\). (b) \(\gamma\)-Variation als Funktion der Anzahl der Zyklen. (c) Verteilungen von \(\gamma\) für dasselbe Erythrozyten während des Zyklustests. (d) Modellanpassungen an die Flächenverkleinerung als Funktion der Anzahl der Zyklen und Vergleiche der Zellfläche zwischen verschiedenen Werten von \(\gamma\). Verstreute Punkte stellen die experimentellen Daten dar (blau: \(\gamma\) = 4,18; grün: \(\gamma\)= 3,75; rot: \(\gamma\)= 3,38 in (b–d). (e) Vergleich des \(\gamma\) für drei verschiedene Gruppen von Zellen. ns bedeutet keine Bedeutung in der Statistik.

Um den aktuellen Gesundheitszustand eines einzelnen Erythrozyten quantitativ zu beschreiben, wird in Gl. ein Ensembleparameter \(\gamma\) definiert. (3) indem man den natürlichen Logarithmus beider Seiten von Gl. (1).

Dieser Parameter umfasst die potenziell zu verlierende Oberfläche \(a\), den Koeffizienten für den exponentiellen Rückgang der Oberfläche \(k\) und seinen aktuellen Zyklusindex \({n}_{0}\). Unter Verwendung der experimentellen Daten eines RBC bei jedem Ermüdungszyklus wird \(\gamma\) einer gegebenen Zelle mit \(\gamma =ln\left({A}_{n}-{A}_{\infty } \right)+kn\) wie in Abb. 6b gezeigt. Es wird beobachtet, dass \(\gamma\) mit den Schwankungen des gemessenen \({A}_{n}\) schwankt.

Die verfügbaren experimentellen Daten liefern Belege für die Verwendung von \(\gamma\) als Ensembleparameter für ein einzelnes Erythrozyten. Die Mediane von \(\gamma\) in jeder Zelle während der mechanischen Zyklen scheinen weitgehend unabhängig von der Anzahl der Zyklen zu sein, wie in Abb. 6b dargestellt. Darüber hinaus entsprechen die Übergangswerte von \(\gamma\), die anhand der aktuellen experimentellen Daten bei jedem Zyklus berechnet werden, einer Gaußschen Verteilung, wie in Abb. 6c dargestellt. Mithilfe der Mediane von \(\gamma\) kann die Abnahme der Oberfläche jedes Erythrozyten desselben Individuums während mechanischer Ermüdung klar kategorisiert werden (Abb. 6d). Nach dem Vergleich der \(\gamma\)-Werte für drei verschiedene Gruppen von Formtransformationen zeigte die statistische Analyse keine signifikanten Unterschiede (Abb. 6e). Unter Berücksichtigung der Messfehler in den vorliegenden Experimenten deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass der Ensemble-Parameter \(\gamma\) eines einzelnen Erythrozyten, wie er durch unser mathematisches Modell bestimmt wird, in der Lage ist, eine quantitative Unterscheidung zwischen dem mechanischen Zyklenverhalten jeder Zelle zu liefern.

Die Änderung des Membranschermoduls eines einzelnen Erythrozyten während des mechanischen Ermüdungsprozesses ist komplizierter als der monotone Abfall der Oberfläche, der auf drei verschiedene Arten variiert, die mit den drei unterschiedlichen Zellformtransformationen verbunden sind, wie in Abb. 4 dargestellt. Und Abb . 5d zeigt, dass die Änderungsrate des Schermoduls eines einzelnen RBC zu Beginn des mechanischen Zyklierens, \({{E}^{^{\prime}}}_{0}\) linear mit seiner Anfangsfläche korreliert , \({A}_{0}\), as

Dabei ist \(g\) die lineare Änderungsrate und \(C\) eine Konstante. Wir verallgemeinern diese lineare Korrelation zwischen der Änderungsrate des Membranschermoduls und der Oberfläche vom Anfangszustand der Zellen auf alle aktuellen Erythrozytenzustände und gehen davon aus, dass \(g\) für alle Erythrozyten eines Individuums als Person konstant bleibt charakteristisch als

Nimmt man Gl. (1) in (5) und Integration der Gleichung mit den Anfangsbedingungen \({Es}_{n}={Es}_{0}\) und \({A}_{n}={A}_ {0}\) bei \(n=0\) wird der Membranschubmodul entlang des mechanischen Ermüdungsprozesses wie folgt formuliert

Dabei ist \(C\) eine Konstante, die für verschiedene Zellen unterschiedliche Werte annimmt. Diese Formulierung des Membranschermoduls besteht aus einem exponentiellen Abfallteil und einem linearen Wachstumsteil, die gemeinsam die Variation des Schermoduls in Bezug auf mechanische Ermüdung zu jeder gegebenen Zykluszeit \(n\) bestimmen.

Das in Gl. dargestellte Modell (6) veranschaulicht drei unterschiedliche Tendenzen für die Änderung des Schermoduls, wie in Abb. 5 dargestellt. Diese Tendenzen hängen von zwei Faktoren ab: \({A}_{0}\) und g. Wenn \({A}_{0}<-C/g\), nimmt der Schermodul zunächst mit mechanischer Zyklisierung ab (\({{Es}^{^{\prime}}}_{0}<0\) ). Wenn umgekehrt \({A}_{0}>-C/g\), erhöht sich der Schubmodul (\({{Es}^{^{\prime}}}_{0}>0\)). Wenn \({A}_{0}=-C/g\), bleibt der Schubmodul konstant (\(Es_{0}^{^{\prime}} = 0\)). Indem man den Schermodul als Oberfläche ausdrückt,

welches die Änderungen des Schermoduls bei Formumwandlungen während der mechanischen Ermüdungsprozesse eines einzelnen Erythrozyten enthält.

Abbildung 7a zeigt, dass Gl. (6) nähert sich den experimentellen Daten eng an das \(g\) an, das durch Übernahme der Änderungsraten des Schermoduls mehrerer Erythrozyten als Konstante desselben Individuums ermittelt wurde. Abbildung 7a zeigt auch, dass während des Ermüdungsprozesses eines einzelnen Erythrozyten der Membranschubmodul zunächst abnimmt, während sich sein Formprofil von becherförmig in diskozytenförmig umwandelt, und dann zunimmt, während es scheibenförmige bikonkave Formen beibehält.

Vergleich des mathematischen Modells (durchgezogene Linie) des Membranschubmoduls mit experimentellen Daten (verstreute Punkte) unter verschiedenen Formtransformationen. (a) Schermodulvariation während mechanischer Zyklen. Unterschiedliche Farben und Linienstile repräsentieren unterschiedliche Formtransformationen, die mit den zyklischen Prozessen verbunden sind. (b) Verhältnis des Schermoduls zur Oberfläche während des mechanischen Zyklierens mit drei verschiedenen Zellen unter unterschiedlichen Formumwandlungen während des Zyklierens von becherförmig zu becherförmig (Rauten), becherförmig zu scheibenförmig bikonkav (Quadrate) und scheibenförmig bikonkav -förmig bis scheibenförmig bikonkav (Kreise). Der Pfeil veranschaulicht die Richtung des Alterungsprozesses unter Verwendung der Anzahl der Zyklen n als Index, die Strich-Punkt-Punkt-Linie stellt eine Erwartung für eine Zelle während eines langen Zyklenprozesses basierend auf Gleichung dar. (7).

Wie in Abb. 7b gezeigt, stellen die durchgezogenen Linien und Streupunkte die Modellvorhersage und die experimentellen Daten von drei verschiedenen Zellen unter jeweils drei unterschiedlichen Formtransformationen dar, was veranschaulicht, dass Gl. (7) ist in der Lage, die Änderung des Membranschubmoduls im Zusammenhang mit der Variation der Oberfläche während des Ermüdungsprozesses näherungsweise vorherzusagen. Abbildung 7b belegt, dass ein einzelnes Erythrozyten bei einer Becherform häufig eine größere Oberfläche aufweist und mit dem Verblassen der Becherform anfängt, die Oberfläche zu verlieren, während gleichzeitig der Membranschermodul abnimmt. Die Erweichung der Erythrozytenmembran hört auf, wenn sich becherförmige Zellen in eine scheibenförmige Form verwandeln. Während dieser Umwandlung verlieren Erythrozyten weiterhin an Oberfläche, aber der Schermodul bleibt relativ konstant und weist während seiner gesamten Lebensdauer keine signifikanten Änderungen um seinen Minimalwert auf. Nachdem die Erythrozyten ihre scheibenförmige, bikonkave Form erhalten haben, beginnen die Erythrozyten während des mechanischen Ermüdungsprozesses zu versteifen, sodass ihre Oberflächen kleiner werden und die Schermodule der Membran zunehmen.

In der vorliegenden Arbeit haben wir für jeden Typ von Formtransformationen, einschließlich Becher-Becher, Becher-Diskozyt und Diskozyten-Diskozyt, mehrere Zellexperimente durchgeführt, wie in Abb. 4 dargestellt, und die Gesamttrends jedes Typs sind konsistent. Aufgrund der derzeitigen experimentellen Bedingungen werden Langzeit-Ermüdungsexperimente für eine einzelne Zelle vom aktuellen Aufbau nicht unterstützt, sodass wir keine direkte Messung des gesamten Ermüdungsprozesses an einer bestimmten Zelle beobachten konnten. Obwohl wir drei unterschiedliche Kategorien zusammenfassen, ist klar, dass die drei Datengruppen gemeinsam eine parabolische Form bilden, wie in Abb. 7b dargestellt. Die anhand der Gleichungen dargestellten physikalischen Modelle. (1), (6) und (7) basierend auf den vorliegenden experimentellen Daten sind einfach. Die hier verwendeten Parameter sind biophysikalisch bedeutsam und spiegeln bestimmte grundlegende Eigenschaften von Erythrozyten mit individuellen Unterschieden der Zellen und der Fitness jeder Zelle wider, wenn sie derselben Person gehört. Obwohl wir derzeit keinen vollständigen Alterungsprozess für eine bestimmte Zelle darstellen können, erfordern Abb. 7b und die Strich-Punkt-Punkt-Linie als erwarteter Trend in der Abbildung fortgeschrittenere Aufbauten für anspruchsvollere Experimente zur mechanischen Ermüdung einzelner Zellen.

Die mechanische Stimulation der Erythrozyten ist entscheidend für die Alterung der Erythrozyten29. Es fehlen jedoch noch quantitative Methoden, um diese Auswirkungen der mechanischen Stimulation auf die mechanischen Eigenschaften einzelner Erythrozyten zu untersuchen. Das in dieser Studie vorgeschlagene Ermüdungsmodell mit Mikroröhren stellt nicht nur die in Umfangsrichtung symmetrischeren Spannungsstimulationen wieder her, während Erythrozyten in vivo wiederholt enge Kapillaren und Schlitze passieren, sondern charakterisiert auch die Änderungen der mechanischen Eigenschaften von Erythrozyten nach jedem Ermüdungsereignis quantitativ mithilfe hydrodynamischer Methoden in situ .

Während des Zyklus führt die mechanische Stimulation zu Veränderungen in der Morphologie der Erythrozyten, was zu einer Verringerung der Fläche und des Volumens der Erythrozyten sowie zu Veränderungen des Schermoduls der Erythrozytenmembran führt. Die in unserer Studie beobachteten Veränderungen der mechanischen Eigenschaften von Erythrozyten ähneln denen, die im Alterungsprozess beobachtet wurden11,12,13,14. Es wird vermutet, dass mechanische Ermüdung die Hauptursache für die in verschiedenen Altersgruppen beobachteten Veränderungen im mechanischen Abbau von Erythrozyten ist. Folglich liefert unser Modell eine Erklärung dafür, wie mechanische Reize zum Alterungsprozess von Erythrozyten beitragen. Das vorliegende mechanische Zyklusmodell unterstützt eingehende Studien zu den physiologischen und klinischen Problemen im Zusammenhang mit der Alterung roter Blutkörperchen.

Die Umwandlung von Retikulozyten in ausgereifte Erythrozyten durchläuft drei verschiedene Phasen: R1: retikuläre Struktur (retikuliert, RNA enthaltend, raue Oberfläche), R2 becherförmige Struktur (becherförmig, RNA enthaltend, raue Oberfläche) und reife Erythrozyten (doppelte konkave Schale). Form)7. Inspiriert durch die morphologische Analyse menschlicher Erythrozyten30,31 spekulierten Forscher, dass es eine R3-Übergangsphase (Becher, RNA-frei, glatte Oberfläche) zwischen R2 und reifen Erythrozyten gibt32. Nach der Durchführung unserer aktuellen Experimente haben wir herausgefunden, dass sich becherförmige Erythrozyten durch mechanische Zyklen in bikonkave Diskozyten verwandeln können. Dieser Prozess führt dazu, dass der Schermodul abnimmt, bis die RBC-Steifigkeit während ihrer Lebensdauer ihren Minimalwert erreicht. Die scheibenförmige bikonkave Form ist eine der stabilsten Formen mit der geringsten Energiemenge, die während des Formumwandlungsprozesses von Erythrozyten benötigt wird. Darüber hinaus nimmt die Verformbarkeit und Stabilität der Erythrozyten während der Umwandlung vom Becher zum Diskozyten zu. Diese Eigenschaften können helfen, die Beobachtungen zur Reifung von Retikulozyten zu erklären, die eine schnelle Abnahme der Fläche und des Volumens der Erythrozyten zeigen, während ihre Zellverformbarkeit und mechanische Stabilität zunehmen33. Daher deuten die experimentellen Ergebnisse zusammen mit dem Ermüdungsmodell darauf hin, dass die Formumwandlung von Bechern zu Diskozyten wahrscheinlich eine Zwischenphase bei der Reifung von Retikulozyten zu ausgereiften Erythrozyten ist, was für die Untersuchung in vitro erzeugter roter Blutkörperchen hilfreich ist.

Erythrozyten sind an den pathologischen Prozessen zahlreicher Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen beteiligt34,35. In Kombination mit der mechanischen Stimulation wirken sich Entzündungen und andere biochemische Stimulationen ebenfalls auf die Alterung der Erythrozyten aus, was durch die Überwachung der mechanischen Eigenschaften der Erythrozyten ein großes Potenzial für die Diagnose und Behandlung von Krankheiten bietet. Hierin erstellen wir ein mathematisches Modell für die Entwicklung der Oberfläche und des Schermoduls eines einzelnen Erythrozyten basierend auf dem Alterungsprozess von Erythrozyten in vitro. Die Parameter, einschließlich der Oberflächenzerfallsrate und der damit einhergehenden Änderungsrate des Schermoduls, sind die intrinsischen Eigenschaften von Erythrozyten, die potenzielle Indikatoren für die quantitative Beschreibung der Unterschiede von Erythrozyten bei verschiedenen Krankheiten sind.

Beispielsweise wird die durch genetische Faktoren bedingte Abnahme der Verformbarkeit und Membranstabilität bei hämolytischen Anämien (z. B. Thalassämie, hereditäre Sphärozytose) häufig durch mechanische Stimulationen in der Milz verschlechtert5. Mithilfe des vorgeschlagenen mathematischen Modells können wir möglicherweise die intrinsischen Eigenschaften von Erythrozyten bei verschiedenen erblichen Blutkrankheiten quantitativ differenzieren. Hier beschreibt k die Fähigkeit von Erythrozyten, der Oberflächenveränderung zur Aufrechterhaltung eines stationären Zustands zu widerstehen, und g spiegelt die Rate der Versteifung von Erythrozyten aufgrund der Umgestaltung des Zytoskeletts wider. Diese Parameter legen einen neuartigen Ansatz zur Diagnose und Überwachung hämolytischer Erkrankungen mit abnormalen Variationen der Oberfläche und Steifheit während des mechanischen Zyklus nahe.

Eine weitere mögliche Anwendung besteht darin, den Einfluss des Blutzuckers auf die Alterung roter Blutkörperchen zu überprüfen. Glykiertes Hämoglobin (HbA1c) steht bei Diabetikern in engem Zusammenhang mit dem Erythrozytenalter36. Mit dem Ensemble-Parameter \(\upgamma\) zur Schätzung des Alters von Erythrozyten könnte HbA1c innerhalb weniger Stunden dynamischer überwacht werden, indem der aktuelle Ermüdungsmodus verwendet wird, um den Alterungsprozess unter ähnlichen biochemischen Umgebungen zu beschleunigen. Alle diese potenziellen Anwendungen erfordern jedoch eine größere Datenakkumulation und ausgefeiltere Versuchsaufbauten für Langzeittests einzelner Erythrozyten mit entsprechenden Kontrollstudien.

Wir haben ein einzelnes mechanisches Erythrozyten-Zyklusmodell entwickelt, um die mechanische Stimulation von Erythrozyten in vivo nachzuahmen. Das Modell nutzt isotrope Stressbedingungen für Erythrozyten, die wiederholt durch enge Lumen, wie z. B. kleine Kapillaren in der Mikrozirkulation oder IES in der Milz, wandern, um die Alterung von Zellen durch Oberflächenverlust wirksam nachzuahmen. Darüber hinaus liefert es in situ präzise Messungen der Oberfläche und des Membranschermoduls während jeder Runde mechanischer Zyklen. Mithilfe eines In-vitro-Ermüdungsmodells haben wir ausgereifte Erythrozyten-Zyklusprozesse in drei verschiedene Gruppen eingeteilt, basierend auf ihren jeweiligen Formänderungen zwischen becherförmig und bikonkav. Obwohl die Versteifung der Zellen während der Ermüdung bei bikonkav geformten Erythrozyten monoton ist, könnten die becherförmigen Zellen abhängig von ihrem anfänglichen und endgültigen Formprofil unter dem mechanischen Wechsel entweder erweichen oder sich stabilisieren. Wir haben auch mathematische Formulierungen basierend auf den experimentellen Daten vorgeschlagen, um die Entwicklung der mechanischen Eigenschaften ausgereifter Erythrozyten anzunähern und zu interpretieren. Mathematische Modelle für die Änderung der Oberfläche und des Membranschubmoduls einzelner Erythrozyten unterstützen einen Ensemble-Parameter zur quantitativen Abschätzung des Gesundheitszustands von Erythrozyten.

Alle Daten sind im Haupttext verfügbar.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant 12072198), dem National Key Research and Development Project of China (2017YFE0117100) und der Shanghai Jiao Tong University (Nr. YG2022ZD004) unterstützt. Wir bedanken uns auch für die teilweise Unterstützung durch den MIT Greater China Fund for Innovation.

Schlüssellabor für Hydrodynamik (Bildungsministerium), Abteilung für Technische Mechanik, School of Naval Architecture Ocean and Civil Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 200240, China

Qiaodong Wei, Xiaolong Wang und Xiaobo Gong

Institut für Photonik und Photonentechnologie, State Key Laboratory of Photon-Technology in Western China Energy, Northwest University, Xi'an, 710100, China

Ce Zhang

Abteilung für Materialwissenschaft und Werkstofftechnik, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, 02139, USA

Ming Dao

State Key Laboratory of Ocean Engineering, School of Naval Architecture, Ocean and Civil Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 200240, China

Xiaobo Gong

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QW, XG hat das Projekt konzipiert. QW entwickelte den Versuchsaufbau und führte Experimente durch. XW stellte eine Simulationsrechnung zur Verfügung. QW, CZ und XG analysierten die Daten, QW, XG schrieben das Manuskript. MD und XG überwachten die Forschung. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Xiaobo Gong.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wei, Q., Wang, X., Zhang, C. et al. Entwicklung der Oberfläche und des Membranschermoduls reifer menschlicher roter Blutkörperchen während mechanischer Ermüdung. Sci Rep 13, 8563 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34605-x

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Eingegangen: 15. September 2022

Angenommen: 04. Mai 2023

Veröffentlicht: 26. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34605-x

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